藥理學實驗指導-第二篇 機能實驗:第十六章 人類疾病動物模型復制

第十六章 人類疾病動物模型復制

第一節(jié)  概述

由于人類疾病的復雜性，醫(yī)學研究中必須對疾病過程進行各種觀察、分析和實驗。這些工作大多不可能在人體上進行，必須借助于適當?shù)膭游锛捌淦鞴佟⒔M織和細胞進行研究。供醫(yī)學研究用的這些動物具有與所研究的人類疾病相似的特點，故稱之為人類疾病動物模型(animal models ofhuman diseases)。人類疾病動物模型通常可以通過人工誘發(fā)，或選擇具有相應特點的自然動物而獲得。

人類疾病動物模型通常依照研究目的而設計，不同的研究選用的動物模型可有很大差別，所以人類疾病動物模型很多，也很復雜。許多人類疾病的動物模型可以自然獲得，即利用動物自發(fā)性的遺傳特性或通過育種手段培育遺傳特性建立而成，如裸鼠、肥胖癥小鼠、自發(fā)性高血壓鼠、自發(fā)性高膽固醇血癥鼠等。

更多的人類疾病實驗動物模型是用人工方法，將致病因素作用于動物，誘發(fā)動物特定器官、組織、細胞或全身的損害，造成與所研究的人類疾病相似的機能、代謝和形態(tài)學的改變�？捎糜谡T發(fā)疾病模型的方法和因素很多，包括物理因素、化學因素、微生物因素以及基因工程技術等。

近年隨著生物技術的發(fā)展，越來越多地應用生物工程技術方法制作動物模型，包括利用動物卵或胚胎移植、胚胎嵌合、細胞核移植、轉(zhuǎn)基因或基因敲除和克隆等技術制作人類疾病的動物模型。

復制的人類疾病動物模型是否能真正地、客觀地反映人類疾病是能否作為研究對象而用于醫(yī)學研究的關鍵。但動物與人類之間存在著很大的差異，任何一種人類疾病的動物模型不可能與人類疾病完全相同，而且影響因素很多，所以在選擇和設計動物模型時要盡可能力求全面周密，在分析實驗結果時要充分考慮動物模型的局限性。

復制人類疾病動物模型有三點最基本的要求：一是復制模型選用的動物應盡可能接近人類，建立的模型必須盡可能地與所研究的人類疾病有相同的或相近的機能、代謝和形態(tài)學變化特點，病變發(fā)生機理應盡量與相應的人類疾病相同；二是選用的方法要保證疾病動物模型復制有較高的成功率，具有較好的可重復性和一定的穩(wěn)定性，以供他人應用和驗證；三是復制成功的動物模型應有明確而可靠的測量或觀察的指標，以供判斷病變的輕重程度和病程的緩急。

應該強調(diào)指出的是，動物模型的設計和選擇都要適合于研究的目的，即便研究同一疾病，但因研究的發(fā)病環(huán)節(jié)不同也不可套用同一動物模型。

本章節(jié)選擇性的介紹幾種嚴重威脅人類生命的疾病和綜合征的動物模型復制方法，供學生在探索性實驗階段參考。

第二節(jié)  動脈粥樣硬化模型

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS)性疾病是目前危害人類健康的“頭號殺手”，動脈粥樣硬化斑塊的形成最常見于大、中動脈。動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展過程大致如下：由于血漿脂質(zhì)水平的升高或同時有其他危險因子的存在，使動脈內(nèi)皮發(fā)生了某種損傷性變化，使血漿脂質(zhì)易于通過動脈內(nèi)膜進入內(nèi)膜下間隙并沉積。同時血流中的單核細胞易與內(nèi)皮細胞發(fā)生粘附，并通過內(nèi)皮細胞間隙跨過內(nèi)皮進入內(nèi)皮下，攝取大量脂質(zhì)而轉(zhuǎn)化成泡沫細胞，形成脂質(zhì)條紋，隨后血管平滑肌細胞向內(nèi)膜方向遷移，并攝入脂質(zhì)和合成大量細胞間質(zhì)，導致動脈粥樣硬化斑塊形成。

AS研究領域中經(jīng)常使用動物模型作為實驗對象，獲得大量實驗結果，大大促進了人們對AS的認識。本節(jié)主要介紹實驗性動脈粥樣硬化動物模型和泡沫細胞模型的復制方法。

一、動脈粥樣硬化動物模型的復制

（一)家兔

家兔是復制動脈粥樣硬化模型最常用的動物，它對外源性膽固醇的吸收率高，可達75～95%，靜脈注入膽固醇后高脂血癥可持續(xù)3～4天。只要給兔含膽固醇較高的飼料，不必附加其它因素，經(jīng)3～4月即可形成明顯的動脈粥樣硬化病變，而且與人體發(fā)生的病變相似，取血檢查也較方便。

通常選用體重2kg左右的新西蘭白兔或日本大耳白兔，每天喂服基礎飼料加膽固醇0.3g，4個月后肉眼可見主動脈粥樣硬化病變；若每天膽固醇劑量增至0.5g，3個月后可出現(xiàn)病變；若增至每天1g，可縮為2個月。在基礎飼料中加入15%蛋黃粉、0.5%膽固醇和5%豬油，經(jīng)3周后，將飼料中膽固醇減去，再喂3周，可使主動脈病變發(fā)生率達100%，血清膽固醇可增高至2000mg%。

促進病變形成的方法：

1．在高脂飼料中還可加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、苯丙胺、維生素D、煙堿或蔗糖等；

2．預先用Fogarty球囊導管插入主動脈，造成內(nèi)皮細胞剝脫的淺表損傷，再喂高脂飼料；

3．靜脈滴注去甲腎上腺素引起血管壁中層彈性纖維拉長、劈裂或斷裂；

4．皮下注射同型半胱氨酸硫代內(nèi)脂（dl-homocysteine thiolactone)可明顯促進動脈粥樣硬化病變。

（二)其他動物

除田鼠和地鼠外，一般溫血動物只會計資格要用適當?shù)姆椒�，都能形成動脈粥樣硬化的斑塊病變。已經(jīng)用于復制動脈粥樣硬化模型的動物除兔以外，還有雞、鴿 、猴 、豬等。 具體選取哪種動物來復制模型，需要根據(jù)實驗目的及觀察指標、實驗時間等。

（三)動脈粥樣硬化動物模型的鑒定

處死動物，選取觀測的動脈，剪開剖面，用蘇丹Ⅳ或者油紅O染色，使病變面積呈現(xiàn)紅色，用計算機圖像處理系統(tǒng)或求積儀計算病變面積百分比。根據(jù)病變面積百分比進行病變分級，判斷粥樣硬化病變的程度。按病變面積百分比分級標準見表15-1。

表15-1 按病變面積百分比分級標準

二、泡沫細胞模型的復制

巨噬細胞和增殖移行的中膜平滑肌細胞表面存在有清道夫受體（scavenger receptor)，能無反饋地攝取大量修飾變性的低密度脂蛋白（LDL)，特別是氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)，使細胞內(nèi)充滿大量脂滴，呈泡沫狀，稱為泡沫細胞。泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變重要的特征性細胞，所以常用Ox-LDL與巨噬細胞或血管平滑細胞共孵育，形成泡沫細胞，作為動脈粥樣硬化研究的實驗模型。

（一)LDL的制備和氧化修飾

1．LDL的制備：見有關專業(yè)書籍。

2．Ox-LDL的制備（LDL的氧化修飾)：

在氧化前，LDL先用無EDTA的PBS液透析24小時，以除去EDTA；再將LDL在含10μmol/L CuSO₄的PBS中，于37℃氧化12小時；然后于4℃，在含100mg/LEDTA的PBS中透析，每8小時換液一次，透析24小時；最后過濾除菌，4℃保存。

（二)巨噬細胞的培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)是把從人體或動物體上取得的組織用機械或消化的方法分散成單個的細胞懸液，然后在模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體外條件下，進行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長。泡沫細胞模型的細胞來源于單核巨噬細胞或血管壁平滑肌細胞。

通常多用小鼠腹腔巨噬細胞與OxLDL共孵育以培養(yǎng)泡沫細胞。步驟如下：選取8周齡、無感染的小鼠，眼球放血或頸椎脫位致死；用70%酒精消毒腹部皮膚，在無菌條件下，用鑷子提起腹部皮膚剪去約3～5厘米長的皮膚，暴露去皮的腹壁；再用注射器將3～4ml無血清的1640培養(yǎng)液注入腹腔，輕揉片刻后抽出腹腔液；將其注入離心管，于4℃，1000rpm/min離心10分鐘，去上清液，加同樣培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1～5×10⁶/ml。若需要的細胞數(shù)多，可將數(shù)只小鼠的細胞收集在一起。而豚鼠、家兔腹腔巨噬細胞的取得，需在數(shù)日前于腹腔注射石蠟油誘發(fā)巨噬細胞在腹腔聚集。

由于巨噬細胞有很強黏附能力，要分離它最常用的方法是貼壁法，即將含有巨噬細胞的懸液加到蓋玻片上、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃培養(yǎng)30～60分鐘，巨噬細胞開始貼壁，此時用Hanks液沖洗5次，以洗去未貼壁的其他細胞，最后得到較純的巨噬細胞，加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，置37℃培養(yǎng)箱。由于巨噬細胞是終末細胞，故不能長期傳代培養(yǎng)。

血管平滑肌細胞的培養(yǎng)可參閱有關書籍。

培養(yǎng)的腹腔巨噬細胞或血管平滑肌細胞傳至3～5代，培養(yǎng)瓶換培養(yǎng)液后，加入已制備好的Ox-LDL，培養(yǎng)48～72小時，觀察細胞形態(tài)的改變及測定細胞內(nèi)膽固醇的含量。

（三)細胞形態(tài)學的觀察

將貼壁于蓋玻片的細胞取出，以PBS液沖洗3次，于10%甲醛中固定24小時，用油紅O方法染色。在倒置顯微鏡下觀察，并以10×100倍彩色照相。

（四)細胞內(nèi)膽固醇（Ch)和膽固醇酯(ChE)的測定

用0.25%胰酶消化1min，收集細胞，以1000rpm/min離心10min，棄去上清液，用PBS液沖洗一次，加入異丙醇0.5ml，在超聲波清洗器上震動10s/min×3次，再以1000rpm/min離心15min。吸取上清液用TC試劑藥盒及FC試劑藥盒分別測定其總膽固醇（TC)和游離膽固醇（FC)，并將其離心沉淀物用0.1mol/L NaOH 0.5ml裂解細胞，用Lowry法測定細胞蛋白含量。細胞內(nèi)的膽固醇含量以TC/g細胞蛋白和FC/g細胞蛋白表示，兩者之差即為ChE/g細胞蛋白含量。

    （楊永宗)

第三節(jié) 糖尿病動物模型

糖尿�。╠iabetes mellitus)是一種古老的疾病，關于糖尿病的記載，最先見于文明古國中國、印度、埃及等國家，約有一千余年至數(shù)千年的歷史。近年來糖尿病的研究進展迅速，雖然許多新的發(fā)現(xiàn)和成就充實了對本病的認識，但病因及發(fā)病機理方面仍未完全闡明。

糖尿病以持續(xù)高血糖為基本生化特征，其病因目前尚無定論。糖尿病不是單一原因與發(fā)病機制引起的疾病，而是由不同原因引起的體內(nèi)胰島素缺乏或胰島素效應降低，臨床以糖代謝紊亂為主的一組代謝性疾病的總稱。按WHO1985年的分型標準，它分為：胰島素依賴型（IDDM，Ⅰ型)、胰島素非依賴型（NIDDM，Ⅱ型)、營養(yǎng)不良性糖尿�。á笮�)和其它類型。IDDM患者的基礎及葡萄糖負荷后胰島素分泌均呈現(xiàn)低水平狀態(tài)，反映了胰島素的完全缺如或嚴重缺乏。NIDDM患者胰島素分泌功能障礙較輕，表現(xiàn)在第一時相缺如及分泌高峰后移，該類患者基礎胰島素分泌常增高或正常，而胰島對葡萄糖刺激的反應減弱，在葡萄糖負荷后胰島素分泌水平較相應體重為低。一般認為IDDM 和NIDDM的發(fā)病與自身免疫、遺傳、病毒感染、胰島素抵抗等有關，繼發(fā)性糖尿病的病因多數(shù)較清楚。在這些因素的作用下，發(fā)生了胰島素的缺乏和作用減低，從而引起體內(nèi)代謝紊亂，導致血糖升高。

對糖尿病研究的重要方法之一是復制糖尿病動物模型，目前能夠用來復制糖尿病模型的動物有地鼠（Carpenter,1970)、大鼠（Maner,1972)、小鼠（Butler,1972)、豚鼠（Munger,1973)、狗（Kramer,1980)、貓（Johnaon,1973)、兔（Roth,1980)、豬（Lang,1977)和靈長類（Howard,1980)。復制糖尿病動物模型有多種，按產(chǎn)生原因分為：（1)自發(fā)性動物模型（spontaneous animal model)，指實驗動物在自然條件下自然產(chǎn)生的、或由于基因突變而出現(xiàn)的類似人類疾病的動物疾�。唬�2)誘發(fā)性動物模型（experimental artificial or inducedanimal model)，指通過物理、化學、生物等致病手段，人為造成動物組織、器官或全身形成類似人類的疾病，動物在功能、代謝、形態(tài)結構等方面有相應的改變。   

一、動物自發(fā)性模型

（一)小鼠

KK糖尿病小鼠是1941年K.Kondo用日本商人的kasukabe小鼠原種群培育而成的，屬先天性遺傳缺陷小鼠。該動物對胰島素不敏感、對葡萄糖耐性小、糖尿病發(fā)病率高、老年動物偶見肥胖。

（二)大鼠

BB Wistar大鼠是一種典型自發(fā)遺傳IDDM型糖尿病動物模型，85日齡出現(xiàn)癥狀，發(fā)病率為50％～70％，臨床表現(xiàn)為多飲、多食、糖尿病、高血壓、酮癥，病鼠胰島內(nèi)β-細胞大量破壞，病理學改變?yōu)橐葝u炎，伴有外周神經(jīng)系統(tǒng)嚴重病變、睪丸萎縮、甲狀腺炎、胃潰瘍、惡性淋巴瘤等。該型與人類發(fā)病年齡較早的少年型糖尿病極為相似。

NIH肥胖大鼠品系（SHR/N-cp)是新培育的一種用于肥胖癥和糖尿病研究的遺傳動物模型。其特征主要是脂肪聚集層，脂肪細胞體積和數(shù)量增加并有損傷發(fā)熱作用。雄性肥胖大鼠有輕度高血壓，當飼喂高糖飲食時，表現(xiàn)出與人NIDDM型糖尿病相似的代謝改變，包括胰島素分泌過多、高血脂，不耐葡萄糖和糖尿病。

（三)地鼠

中國地鼠（黑線倉鼠)有50％自發(fā)性產(chǎn)生糖尿病，屬多基因遺傳，病鼠耐糖曲線似人類NIDDM糖尿病。

（四)新西蘭白兔

美國退伍軍人管理局醫(yī)療中心于1969年發(fā)現(xiàn)一只6～12月齡的雌性新西蘭白兔有煩渴和多尿現(xiàn)象，血糖和尿糖均明顯增高，確診為糖尿病。經(jīng)連續(xù)幾代近親繁殖，遂形成具有自發(fā)性糖尿病的一個品系。其中19％為顯著高血糖及糖尿的顯性糖尿病兔，另外27％的兔空腹血糖正常但處理靜脈注射葡萄糖能力異常。這兩種兔的其他一些特征包括煩渴、多尿、貪食、胰島素釋放嚴重受損及胰島β細胞顆粒增多。這些兔不肥胖，且有輕度酮癥酸中毒。病理學發(fā)現(xiàn)，糖尿病兔的特殊損害局限在胰島β細胞及腎臟。本動物模型與人類的IDDM或青少年中成年發(fā)作型糖尿病極為相似。

二、 誘發(fā)性動物模型

誘發(fā)性糖尿病動物模型的復制方法有多種，包括手術、化學物質(zhì)損傷、微生物感染、營養(yǎng)源性誘導等等。

（一)手術

自從德國的Von Mening將犬作胰腺全切除術造成糖尿病后，陸續(xù)報道貓、大鼠、兔、豬、猴等切除80％～90％胰腺并受到高糖飲食刺激后，出現(xiàn)β細胞退變衰竭而引起永久性糖尿病。

（二)化學物質(zhì)損傷

用化學物質(zhì)損傷來復制糖尿病動物模型，可用的方法有：

1．注射致高血糖因子；

2．注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ)；

3．注射環(huán)丙庚哌；

4．注射四氧嘧啶（alloxan)破壞胰島β細胞，造成胰性糖尿�。�

5．注射根皮苷。一般以后兩種方法最常用。

(1)四氧嘧啶

①復制機理

用適量的四氧嘧啶注入動物體內(nèi)，可選擇性地損害胰島的β細胞，使β細胞制造胰島素的功能發(fā)生障礙而導致血糖過高和糖尿病。這是由于四氧嘧啶化學性質(zhì)極不穩(wěn)定，易與巰基（主要是半胱氨酸)發(fā)生反應，而胰島的β細胞中巰基含量較其他組織為多，故四氧嘧啶只選擇性地損害胰島的β細胞。

四氧嘧啶復制的糖尿病動物模型是目前研究人類糖尿病較好的方法，主要優(yōu)點有：（a)實驗性糖尿病近似人類糖尿�。唬╞)體內(nèi)代謝障礙時有可能產(chǎn)生此種衍生物；（c)胰島外分泌部分不受損傷；（d)幾乎所有常用實驗動物都可用來進行實驗研究；（e)胰島的β細胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰島組織再生和功能恢復；（f)動物不必注射胰島素可存活很久。

②復制方法

大白鼠  

實驗前四天，給大白鼠腹腔內(nèi)注射新鮮配制的四氧嘧啶（2.5％或5％生理鹽水溶液)，劑量為12mg/100g體重。注射后血糖呈幾個時相的變化，在注射第四、五天后即可造成持續(xù)高血糖。實驗中每天注意給動物充分供應飲水，以便獲得較多尿量，用以測定尿中糖含量。如在冬季，大白鼠飲水少，則可由食管插管按5ml/100g體重喂水。

家兔 

 取體重1.5kg以上健康家兔，先測定正常血糖量，并檢查尿內(nèi)有無糖后，靜脈注射四氧嘧啶溶液150～200mg/kg體重，然后有計劃地觀察血糖、尿糖、體重和食欲情況的變化。有的家兔在注射后10～15天排除中毒現(xiàn)象后，即可正式進行四氧嘧啶性糖尿病的實驗觀察。

家犬   

實驗前二周，靜脈注入新鮮配制的四氧嘧啶溶液（1～3％)，劑量為50～60mg/kg體重。在注射后24～48小時，即可出現(xiàn)持久性的高血糖和糖尿。

注意事項：四氧嘧啶模型與人的糖尿病類似，但注射藥物后，血糖值迅速下降，繼而又很快上升且有幾次起伏，幾天后方形成持久性高血糖。另外，注射四氧嘧啶后，有時可在24小時以內(nèi)死于低血糖昏迷，可用50％葡萄糖水溶液喂動物搶救。

(2)根皮苷

① 復制機理

根皮苷是一種配糖體，系由蘋果樹的根皮抽提而得。其所以引起糖尿病，是因為根皮苷能使腎小管對糖的再吸收發(fā)生障礙（排糖閾降低)。根皮苷可能有破壞酯酶的作用，致使葡萄糖磷酸化過程和脫磷酸過程障礙，引起糖尿病。

②復制方法

使用的動物為健康家兔，首先測定正常血糖含量和尿糖定性，在確定血糖含量處于正常范圍內(nèi)和尿內(nèi)無糖時，以0.5％根皮苷按15ml/kg體重的劑量作皮下注射，同時收集24小時尿液，然后測定血糖含量和尿糖定性。為了增加尿量，可多飼以白菜。

注意事項：根皮苷溶液要新鮮配制，配時取0.5g根皮苷溶于100ml的1％NaHCO₃溶液中。

(3) 鏈脲佐菌素

一次性腹腔注射或靜脈注射30mg/kg～100mg/kg，幾天后使狗、大鼠等動物產(chǎn)生永久性高血糖，但鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ)造成糖尿病的同時，還可造成白內(nèi)障、冠狀動脈粥樣硬化斑塊。 

(4)環(huán)丙庚烷（cyproheptadine)

給大鼠連續(xù)給藥4周后，可見高血糖癥狀，并出現(xiàn)胰島素β細胞的分泌顆粒逐漸消失。胰島素分泌在安靜時呈正常值，當補充葡萄糖過量時，則不能引起胰島素的補充分泌，這與人類糖尿病患者動態(tài)極為相似，停藥一周后，病態(tài)可自動恢復，該模型比上述模型更接近于人體發(fā)病形式。

（三)微生物感染

腦炎心肌炎（EMC)病毒的M型變異株可在若干品系的成年小鼠中誘發(fā)糖尿病。在DBA/2品系小鼠中發(fā)病率大于70％，而在CD-1小鼠中約為40％，在C3H、C57BL、BALB/CJ與A/J小鼠中發(fā)病率少于10％。雌雄均能感染EMC病毒，雄性的發(fā)病率明顯大于雌性。皮下接種病毒4～7天后可出現(xiàn)明顯的高血糖，伴有血中及胰腺組織中胰島素含量降低。高血糖通常為短暫性，但許多小鼠在恢復期仍顯示糖耐量異常。EMC病毒感染小鼠后出現(xiàn)的疾病在生化方面與人類青少年發(fā)病的IDDM糖尿病極為相似。

（四)營養(yǎng)源性

用含10％氧化的長頷竹刀魚油的飼料喂養(yǎng)鯉魚60天，即能誘發(fā)鯉魚營養(yǎng)源性糖尿病。本病的臨床特征包括高血糖、糖尿、糖耐量降低與偶有酮尿。組織學研究表明其胰島、腎小球等部位的損害與人類糖尿病中所見者極相似。該疾病模型與人類青少年發(fā)病的IDDM糖尿病極為相似。

最近有報道，用含10％豬油、37％蔗糖的飼料喂養(yǎng)新西蘭白兔也能誘發(fā)糖尿病，但該模型尚在研究中。

（五)轉(zhuǎn)基因糖尿病動物模型

雖然轉(zhuǎn)基因動物這一生命科學研究的新體系引入到糖尿病的研究領域時間并不長，但已取得了驚人的成果。轉(zhuǎn)基因動物模型在糖尿病研究中的運用仍然方興未艾。1998年，Allison等在《Nature》上報道，第一類組織相容性抗原復合物（MHC-1)基因（H-2Kb)，該基因是大鼠的胰島素啟動子，在小鼠的胰腺β細胞中高表達，復制成轉(zhuǎn)基因小鼠。這種動物模型的胰島素分泌降低，與人類的IDDM糖尿病相似。

利用轉(zhuǎn)基因的方法建立人類疾病動物模型和用其他方法相比具有許多優(yōu)點。諸如遺傳背景清楚，遺傳物質(zhì)改變簡單，建立的模型更自然和更接近病人癥狀；建立過程操作簡單，周期短，而且建立的轉(zhuǎn)基因動物模型不需要特殊的飼養(yǎng)條件即可保持疾病癥狀，按照孟德爾規(guī)律代代相傳，維持費相對較低等等。但是由于轉(zhuǎn)基因方法和技術上的原因，目前轉(zhuǎn)基因糖尿病動物模型尚處于研究階段，相信隨著轉(zhuǎn)基因技術的不斷完善，人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型會不斷涌現(xiàn)。

（袁中華)

第四節(jié)  心、腦缺血-再灌注損傷動物模型

心、腦血管缺血性疾病是嚴重威脅人類健康的一大類疾病，椐統(tǒng)計，我國每年新發(fā)生的腦卒中有150萬人，每年死于心血管疾病的在200萬人以上，恢復缺血組織的血液灌注是治療的目的，但在某些情況下，再灌注會加劇組織的損傷，其發(fā)病機制至今尚未闡明。因此，研究心、腦缺血-再灌注損傷的發(fā)病機制及其防治，具有重要的理論價值和實踐意義。

一、在體心臟缺血-再灌注損傷模型

（一)實驗目的

復制心臟缺血-再灌注損傷動物模型，觀察再灌注過程中心功能的變化及再灌注性心律失常表現(xiàn)。為研究心臟缺血-再灌注損傷的機制及其防治打下基礎。

（二)實驗動物

雄性健康大白鼠，體重200~300克。

（三)藥品、器材

多功能生物信息采集儀或二道生理記錄儀，小動物人工呼吸機，小動物常規(guī)手術器械，左心室導管，直徑3mm 、長2cm的充氣硅膠管，小拉鉤。小圓針，5/0號線。

（四)觀察指標

1．心電圖

2．心功能檢測指標：左室內(nèi)壓（LVP)，左室內(nèi)壓變化最大速率（±dp/dtmax)，左室舒張末期壓（LVEDP)

（五)實驗步驟

1．動物稱重后，腹腔內(nèi)注射12%水合氯醛40mg/100g體重麻醉動物，并將其仰臥固定 

于手術臺上。

2．作頸部正中切口，分離氣管并插入氣管插管，分離右頸總動脈，結扎遠心端，近心端用動脈夾夾閉，在靠近結扎線處剪口，插入左心室導管，用線輕扎固定后松開動脈夾，然后將導管緩慢插入左心室，雙重結扎固定，并連接多功能生物信息采集儀或生理記錄儀用于測定心功能，連接標準肢體Ⅱ?qū)��?lián)記錄心電圖。

3．胸骨左側旁約0.5cm處、第3~5肋間作切口開胸，立即行呼氣末正壓呼吸（吸室內(nèi)空氣，通氣量為2ml/100g體重，呼吸頻率50~60次/min)，剪開心包膜暴露心臟，以左冠狀動脈為標志，在左心耳根部下方2mm處用穿好5/0號線的無創(chuàng)小圓針穿過左冠狀動脈下方的心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針，將心臟放回原處。

4．待心電圖穩(wěn)定10分鐘后記錄心電圖、LVEDP及±dp/dtmax 。

5．靜脈注入肝素100~200U, 在左冠狀動脈穿線上方放置硅膠管并結扎動脈，使之壓迫血管造成血管閉塞和左室壁缺血5~10分鐘，每隔2分鐘記錄心電圖及心功能指標，然后剪開結扎線，移去硅膠管，恢復血液灌流，繼續(xù)觀察30~60分鐘。

6．記錄解除結扎即刻及隨后動態(tài)的心電圖和心功能指標變化。

二、離體心臟缺血-再灌注損傷模型

（一)實驗目的

學習Lagendorff離體心臟灌流技術，復制離體心臟缺血-再灌注損傷模型，觀察再灌過程中心臟功能、代謝及心電圖的變化。為研究心臟缺血-再灌注損傷的機制及其防治打下基礎。

（二)實驗動物

健康雄性大鼠，體重200~300克。

（三)藥品、器材

Lagendorff離體心臟灌流裝置，超級恒溫水浴，恒溫水浴器，氧氣袋，O₂ 、CO₂、N₂鋼瓶，721分光光度計，多功能生物信息采集儀，天平，小動物手術器一套，Krebs-Henseleit緩沖液（K-H液)，水合氯醛，肝素，玻璃插管等。

   （四)觀察指標

1．冠脈流出量（ml/min/g組織濕重)；

2．乳酸脫氫酶（LDH)含量；

3．心電圖；

4．心功能：±dp/dtmax, LVP，LVEDP 。

   （五)方法、步驟

1．Lagendorff離體心臟灌流模型的制備

（1)物稱重后用12%水合氯醛40mg/100g體重（或氯氨酮8~10mg/100g體重)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上，經(jīng)尾靜脈或股靜脈注入肝素鈉100~150U/100g體重，注射完畢后2分鐘開始手術。

（2)肋骨下緣橫向剪開腹前壁，再縱向剪開兩胸側壁和橫膈前緣，將胸壁向頭端翻起分離出心臟后以左手姆指和食指輕輕提起，暴露出各大血管，在距主動脈起始部4~5mm處，用眼科剪將肺與心臟一同剪下，置于預冷的0^оC~4^оC的K-H液中。

（3)立即行主動脈插管、固定，并迅速經(jīng)插管（可用注射器與之相連)注入K-H液，沖洗出冠脈血管內(nèi)的殘留血液，然后將主動脈插管與Lagendorff灌流裝置相連，讓心臟懸掛于灌流裝置上,灌流約30秒。

（4)肺動脈圓錐處剪一小口，用線結扎肺門根部血管，剪去肺及縱隔組織。

（5)左心房插管與前負荷瓶相連，荷包縫合固定；調(diào)整左室前負荷為15cmH₂O(147Pa),待心跳規(guī)則后，即改為從左心房導管灌入K-H液，液體經(jīng)左室收縮泵入主動脈，部分液體進入冠脈，流至右房，經(jīng)右心室從肺動脈圓錐流出，收集在燒杯中，用來測定冠脈流出量及乳酸脫氫酶含量，左室后負荷為60~75mmHg (8~10kPa)。持續(xù)向K-H液中通以（95%O₂+5%CO₂)混合氣體。灌注壓為7.9 kPa,灌注速度為10ml/min 。心臟維持濕潤及37^ΟC恒溫。

（6)經(jīng)心尖部向左心室插入心導管，與壓力傳感器及多功能生物信息采集儀相連，測定心功能；連接心電圖描記裝置記錄心電圖；穩(wěn)定10分鐘后，記錄各指標。乳酸脫氫酶（LDH)含量測定方法見藥盒說明。

2．心臟缺血-再灌注損傷模型的制備

（1)用穿好5/0號線的無創(chuàng)小圓針穿過左冠狀動脈下方的心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針，在血管上方放置一小段硅膠管并結扎造成左心缺血10~20min ，記錄結扎前及結扎后即刻、5min、10min、15min、20min心電圖及心功能變化，并測定冠脈流出量及LDH。

（2)松開結扎恢復灌流，繼續(xù)觀察10~20min ，并在松開結扎后即刻、30s、60s、1min、2min 、5min、10min、15min、20min記錄上述指標的變化。

3．氧反常及鈣反常的復制

（1)氧反常的復制方法：仍采用上述Lagendorff離體心臟灌流模型,先用通入（95%O₂+5%CO₂)混合氣體的K-H液灌流20min , 然后改用無糖的、通入（95%N₂+5%O₂)混合氣體的K-H液灌流90~120min , 再恢復先前的富氧含糖K-H液灌流5~10min,并動態(tài)記錄前述指標變化.

（2)鈣反常的復制方法:：采用Lagendorff離體心臟灌流模型,先用富氧含鈣的K-H液灌流20min ,然后改用富氧無鈣的K-H液灌流5~10min ,再恢復富氧含鈣K-H液灌流, 繼續(xù)觀察5~10min , 并動態(tài)記錄前述指標變化.

附：K-H液的組成（mmol/L)：NaCl:118, KCl: 4.7,MgSO₄,:1.1,KH₂PO₄:1.18, NaHCO₃: 24.5, CaCl₂:2.55。Glucose:11.1（臨用前加)，pH 7.4 。

三、腦的缺血-再灌注損傷模型

（一)四血管阻斷模型

1、實驗目的

復制腦缺血-再灌注損傷的動物模型，觀察動物腦再灌注損傷的表現(xiàn)，為研究腦缺血-再灌注-損傷的機制及其防治打下基礎。

2、實驗動物

雄性健康大白鼠，體重200~300克。

3、藥品、器材

多功能生物信息采集儀，小動物人工呼吸機，三棱針，不銹鋼電極，小動物手術器械，12%水合氯醛等。

4、觀察指標

腦電圖，瞳孔及結膜顏色，心電圖。

5、實驗步驟

（1)物稱重后，用12%水合氯醛40mg/100g體重行腹腔麻醉。

（2)臥位固定，沿頭頂部正中線切開皮膚，在右冠狀縫后，中線旁開各約1mm處用三棱針鉆透顱骨達骨膜外，將開口稍加擴大，安裝不銹鋼電極，作記錄腦電圖用。

（3)將動物改為仰臥位，作頸部正中切口，分離氣管并插管固定；分離兩側頸總動脈，置套扣備用。

（4)將頸部切口稍往下延伸沿右側頸總動脈向近心端分離，找到鎖骨下動脈的起始段，分離鎖骨下動脈并穿線備用；沿左頸總動脈向下分離，找到左鎖骨下動脈的起始段，分離該動脈并穿線備用。

（5)使用小動物呼吸機進行人工呼吸（通氣量為2ml/100g體重，呼吸頻率48~50次/min)；將安裝在頭頂部的不銹鋼電極與多功能生物信息采集儀的腦電圖負極相連，再將參比電極插在同側耳根皮下，然后連接標準肢體Ⅱ?qū)��?lián)，同步記錄腦電圖和心電圖。

（6)用小動脈夾夾閉雙側頸總動脈和鎖骨下動脈，分別于夾閉后即刻、5min、10min和15min重復記錄腦電圖和心電圖，并觀察瞳孔和結膜顏色的變化。

（7)松開動脈夾，于松開后即刻、10min、20min、40min和60min記錄腦電圖和心電圖，并密切觀察瞳孔和結膜顏色的變化。

此模型可造成動物全腦缺血-再灌注損傷，成功率較高，穩(wěn)定可靠，但對呼吸循環(huán)影響較大，必須使用人工呼吸機。

（二)線栓大腦中動脈模型

本方法的特點是在不開顱的情況下，用尼龍線栓塞大腦中動脈造成局灶性腦缺血，抽出尼龍線形成再灌注。在實驗操作上是分離出頸內(nèi)、外動脈后，將頸外動脈的分支及其終末支以及頸內(nèi)動脈的的顱外分支全部結扎，使頸內(nèi)動脈成為頸總動脈在顱外的唯一分支，然后導入尼龍線。

1、實驗動物

大鼠，體重350~ 500g 。

2、藥品、器材

12%水合氯醛、0.3mm的硅化的尼龍線、小動脈手術器械等

3、實驗步驟

（1)用12%水合氯醛（40mg/100g體重)行腹腔麻醉，仰臥固定于手術臺上。

（2)頸部正中切口，在一側肩胛舌骨肌和胸鎖乳突肌形成的暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，然后分離頸外動脈的分支枕動脈、甲狀腺上動脈、舌咽動脈及其終末分支，并結扎之。分離頸內(nèi)動脈及其顱外分支，并將其顱外分支結扎。

（3)動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，用一線繞住頸外動脈的殘余部并在結扎線的下方（近頸內(nèi)、外動脈的分支處)剪一小口，由此插入預先硅化好的3cm長、0.3mm粗的尼龍線，松開頸內(nèi)動脈夾，小心地將尼龍線導入頸內(nèi)動脈，并仔細觀察辨認位置是否正確，然后繼續(xù)向前推進至頸內(nèi)動脈的顱內(nèi)段（從插入前端到頸總動脈分支處長度約為2cm)，當有明顯的阻力感時，即可阻斷大腦中動脈。

本模型的優(yōu)點是無須開顱，重復性好，與臨床較為接近，適用于腦缺血-再灌注損傷的病理生理研究。缺點是手術方法較為煩瑣。

4、大鼠局灶性腦缺血評分方法：大鼠清醒后，根據(jù)其行為評分：

（1)提鼠尾離地面約1尺，有左肩內(nèi)旋、左前肢內(nèi)收者，記4分，否則為0分，正常鼠則兩前肢對稱地伸向地面。

（2)將動物置平滑地板上，分別推左（或右)肩使其向?qū)�側移動，檢查抵抗推動的阻力，若發(fā)現(xiàn)推其右肩向左側移動時阻力明顯低于對側者，根據(jù)其降低程度的不同，記1~3分，正常大鼠兩側阻力明顯對稱。

（3)將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力，若左前肢肌張力低于對側者，視其降低的程度，記1~3分，正常大鼠兩前肢肌張力明顯對稱。以上評分滿分為10分，記分越高，說明缺血-再灌注損傷越嚴重。還可將腦組織染色測定梗塞面積，根據(jù)梗塞面積大小判定損傷的程度。

  (馮大明)

第五節(jié) 胃癌實驗動物模型

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國的發(fā)生率和死亡率仍居首位。建立類似人胃癌的動物模型是研究胃癌的病因、發(fā)生、發(fā)展及實驗性防治的重要手段和方法。胃癌實驗動物模型分為誘發(fā)性與移植性兩大類。

一．誘發(fā)性胃癌模型

理想的實驗性胃癌模型必須具備下列要求：①致癌物質(zhì)必須容易合成或取得；②能在各種動物中致癌；③致癌方法簡單易行；④致癌周期短，癌變率高；⑤對胃有特異選擇性；⑥所誘發(fā)的胃癌的病理類型、生物學行為、電鏡表現(xiàn)及組織化學改變等與人類胃癌有相似性。

（一)致癌劑（carcinogen)

目前，誘發(fā)性實驗性胃癌采用的致癌劑多為亞硝胺類，如甲基硝基亞硝基胍（MNNG)、甲基硝基亞硝基脲（ENNG)、甲基芐基亞硝胺（MBNA)等或芳香多環(huán)烴類（如3－甲基膽蒽、3，4－苯并芘、7，12－二甲基膽蒽、20－甲基膽蒽等)。

（二)實驗動物（experimental animal)

實驗性胃癌模型的成功與否和實驗動物的選擇密切相關。一般所用的實驗動物有大鼠、小鼠、地鼠、犬等，而最常用的是大鼠，其飼養(yǎng)方便，胃癌誘發(fā)率高。大鼠的胃分為前胃和腺胃兩部分，前胃占整個胃的1/3~1/2左右，由鱗狀上皮細胞構成，腺胃由腺上皮細胞構成，前胃和腺胃之間有高出粘膜的界嵴相隔。因此。前胃誘發(fā)的是鱗狀細胞癌，腺胃誘發(fā)的是腺癌。實驗證明，不同種系大鼠的胃對致癌物的易感性不同，有人發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠對MNNG較敏感，雄性大鼠的胃癌誘發(fā)率高于雌性大鼠。不同周齡的大鼠對MNNG較敏感性亦不同，一般幼齡大鼠較成年鼠更敏感，因此，選用2~4月齡、體重100~200g的大鼠較為妥當。

（三)實驗方法（experimental method)

1．線結穿掛法：取小鼠或大鼠，行無菌手術，在腺胃粘膜面穿掛含甲基膽蒽（MC)的線結。含MC線結是用普通細線，在一端打結后，將線結置于盛有MC的玻璃試管內(nèi)，在乙醇燈上微微加熱，使MC液化滲入線結。一般MC的量為0.05~0.1g,可制10~20根線，每根線結約含5mg。手術埋線后大約半個月~1個月即可形成早期浸潤癌，3~4個月誘癌率最高，且誘發(fā)的胃腺癌與人胃癌相似。本校腫瘤研究所（1977)在20-甲基膽蒽誘發(fā)大鼠胃腺癌病理形態(tài)學動態(tài)觀察中，提出胃癌發(fā)生過程為：MCA→腺胃粘液頸細胞增殖、分化異�！�腸上皮化生→腺瘤性增生或不典型增生→早期癌→浸潤癌。

2．MNNG誘發(fā)法：給藥方法有三種：

（1)連續(xù)給藥法：即從實驗開始至結束每日給大鼠飲用MNNG溶液，誘癌周期一般需一年或一年半。此法給藥時間持續(xù)，藥物積累多，劑量大，誘發(fā)胃癌的發(fā)生率高，但胃外腫瘤發(fā)生率也較高。Sugimura（1967)用6周齡的雄性Wistar大鼠進行研究，用33µg/mlMNNG溶液飲用的12只大鼠366~542天后，有8只在胃腺部發(fā)生腺瘤，4只為胃腺癌。另4只大鼠用83µg/mlMNNG溶液飲用6個月后改用167µg/mlMNNG飼養(yǎng)至371~382天，1只發(fā)生胃腺癌和腺瘤，2只發(fā)生腺瘤，1只為腺瘤伴平滑肌瘤。胃腫瘤主要發(fā)生在幽門區(qū)和胃竇部，腫瘤大小由粟粒斑塊樣到指尖大小的結節(jié)，并侵及漿膜。但在十二指腸、空腸和近端腸系膜有肉瘤發(fā)生。本校腫瘤研究所應用自制合成的MNNG先后成功復制大鼠胃腺癌（1979)。隨后，用500µg/mlMNNG溶液，采取連續(xù)定量法誘發(fā)Wistar大白鼠胃腺癌病理形態(tài)學動態(tài)觀察中（1988)，在第84、168、217天分別誘發(fā)出粘膜內(nèi)癌、早期浸潤癌及浸潤癌與多灶性癌（47例胃癌共97個癌灶)，獲得較高誘癌率（47/80)，癌灶大部分位于胃竇，粘膜混濁、灰白或灰黃是胃癌的最早期改變，認為胃癌變過程為：MNNG → 粘膜糜爛、缺損 →腺體再生性增生→腺瘤性增生（息肉和腺瘤)或不典型增生→早期癌（粘膜內(nèi)癌和早期浸潤癌)→浸潤癌。同時，誘發(fā)出前胃鱗癌，誘癌率分別高達58.3%(-12月)、86.7%（-14月)、86.7（-20月)。此外，誘發(fā)胃平滑肌肉瘤13例。

（2)間隔給藥法：有人選用SD系大鼠，用80mg/kgMNNG溶液喂養(yǎng)，每周一次，一共12周。給藥后直至大自然死亡（平均226天)，病理解剖時發(fā)現(xiàn)，腫瘤多發(fā)于前胃（88/89)，胃腺癌發(fā)生率僅3/98。同時發(fā)現(xiàn)30%的大鼠有肝臟退行性改變、局灶性壞死和膽管增生性損害，可能單劑量過大引起。

（3)限期給藥法：即以實驗性開始連續(xù)給藥6~7個月后停藥連續(xù)飼養(yǎng)，直至自然死亡后進行尸檢，發(fā)現(xiàn)胃腺癌發(fā)生率達40%，而連續(xù)飼養(yǎng)同劑量MNNG的大鼠只有16%，說明限期給藥法誘癌率高，專一性強。

大動物中多選用犬制作實驗性胃癌。犬的胃組織結構與人胃相似，可進行X線檢查、內(nèi)鏡檢查和活檢，有利于對癌腫的發(fā)展過程、早期診斷、化療效果評價等進行研究，但誘癌時間較長，一般要2年或更長的時間，費用較高，飼養(yǎng)管理較困難。MNNG化學性質(zhì)不穩(wěn)定，不能與食物混合喂養(yǎng)，而且容易誘發(fā)犬腸道平滑肌肉瘤而導致犬死亡。有人介紹用MNNG的乙基衍生物N-乙基-N`-硝基-N-亞硝基胍（ENNG)能成功地誘發(fā)胃印戒細胞癌，誘癌特異性強，其大體形態(tài)、組織學分型及腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑均與人胃癌相似，并且小腸腫瘤發(fā)生率低。ENNG給藥方法有兩種：①將ENNG制備成1~1.5g/L溶液儲存，給藥時再用自來水稀釋至100~150µg/ml，由犬飲用，容器需避光。給藥150µg/ml 6個月或100µg/ml 9個月后停藥，大都在18個月后出現(xiàn)胃癌。②將ENNG溶解在含2%吐溫溶液中，混入犬的固體顆粒飲料中喂食，每日2次，持續(xù)8個月。由于固體食物在胃內(nèi)停留時間較長，能延長藥物與胃粘膜的作用時間，縮短誘癌時間，增加誘癌效果。本校腫瘤研究所分別用MNNG、ENNG誘發(fā)了狗微小胃癌和癌前病變（1985)，發(fā)現(xiàn)胃癌的組織發(fā)生為多中心起源。

二．移植性胃癌模型

移植性腫瘤是指人或動物的腫瘤組織移植到異種或同種動物，傳代后其組織類型、生長特性穩(wěn)定，并能在受體動物身上繼續(xù)傳代成為可移植性瘤株。Rydard(1969) 首次將人結腸癌皮下移植于免疫缺陷動物裸小鼠獲得成功，開創(chuàng)人鼠異種移植模型的新時代。80年代中期，國內(nèi)外開始用體外培養(yǎng)的人胃癌細胞移植于裸鼠皮下，但因長期體外培養(yǎng)過程諸多因素的影響，其生物學特征與原發(fā)瘤有較大差異。

我校腫瘤研究所（1991)分別將人胃粘液癌和乳頭狀腺癌組織移植于裸鼠皮下，經(jīng)鼠間傳代20代以上，建立了GC－916與GC－915兩株人胃癌裸鼠移植瘤株，經(jīng)病理學、組織化學、免疫病理學和超微結構觀察，證實裸鼠移植瘤保持了原發(fā)人胃癌的結構和功能，并具有表達突變型p53、rasp21蛋白及產(chǎn)生CEA的特性。

皮下移植模型雖能保持原發(fā)瘤的組織類型和生化特征，但缺乏人胃癌最典型的轉(zhuǎn)移特性。為了克服這一缺陷，Hoffman（1991)創(chuàng)立了外科原位移植方法，即將新鮮的人腫瘤組織通過手術原位移植于裸鼠體內(nèi)建立轉(zhuǎn)移鼠模型。此新型模型不但保持原發(fā)瘤組織結構，而且較完整表達其包括轉(zhuǎn)移在內(nèi)的生物學行為。因此，它可廣泛用于腫瘤轉(zhuǎn)移機制、抗腫瘤治療及尋找新的腫瘤基因。轉(zhuǎn)移鼠模型無疑是這個領域近年來的重大進展，這將預示每個腫瘤患者都可由其自身腫瘤建立的轉(zhuǎn)移鼠模型作為臨床實踐標準的新紀元的到來。

此外，裸鼠體內(nèi)人類器官移植為誘癌實驗奠定了基礎，如人胚胎氣管、支氣管、鼻咽移植，分別誘發(fā)氣管癌、支氣管癌、鼻咽癌。我校腫瘤研究所（1995)用人胚胎胃粘膜成功移植于裸鼠，并用MNNG誘發(fā)了胃粘膜不典型增生與裸鼠平滑肌肉瘤。

  （蘇琦)

第六節(jié)  肝纖維化動物模型

各種損傷因子所致的肝臟損傷，各種疾病引起的慢性肝病，都可使肝臟發(fā)生炎癥、肝細胞壞死、纖維組織增生進而繼發(fā)肝纖維化的病理改變。肝纖維化是指肝細胞受炎癥刺激及壞死時，肝臟內(nèi)纖維結締組織異常增生的病理過程，輕者稱為纖維化；重者進而使肝小葉結構改建、肝細胞結節(jié)狀增生及假小葉形成，稱為肝硬化。生物化學測定，每克正常肝組織濕重平均有5.5~6.5毫克的膠原，而硬化的肝臟可高達20毫克以上。

肝纖維化（硬化)動物模型的建立，是開展肝纖維化（硬化)基礎研究及實驗治療研究的重要手段。許多因子可以在實驗動物引起肝纖維化（硬化)。在實驗動物身上施以不同性質(zhì)、不同劑量及不同作用方式的肝毒劑，可造成不同類型的肝纖維化（硬化)模型。按損傷因素和病因分類，主要有下述六種類型，對各種類型的肝纖維化（硬化)動物模型原理及造模方法作一全面的了解，有利于科研中選擇和應用較為理想的肝纖維化（硬化)動物模型。

本節(jié)將各種肝纖維化（硬化)動物模型復制方法分述于下。

一、化學性損傷模型

（一)CCl₄中毒性肝纖維化（硬化)模型

四氯化碳（CCl₄)為一種選擇性肝細胞原漿毒性藥物，其作用機制為四氯化碳進入肝臟后引起肝小葉內(nèi)中央靜脈周圍肝細胞壞死，繼而引起以肝小葉內(nèi)竇間隙為主的纖維組織增生，通過四氯化碳制備肝纖維化（硬化)模型的途徑有口服、腹腔注射及皮下多點注射等。實驗動物一般采用雄性Wistar大鼠，雌性大鼠肝纖維化形成率低。方法有以下幾類：

1．單純CCl₄法：一般采用如花生油、橄欖油等作溶劑制成50%CCl₄油劑。0.1~0.3ml/100g體重皮下或腹腔內(nèi)注射，每周2次。肝纖維化形成時間較長，一般在12~15周，動物死亡率也較高。

2．CCl₄加苯巴比妥誘導法：于飲水中加入苯巴比妥（300~400mg/L)，同時CCl₄蒸氣吸入或灌胃。灌胃方法為：在飲用苯巴比妥2周后，CCl₄灌胃，開始劑量為0.04ml，以后按體重增減調(diào)整CCl₄用量，每周給藥1次。此法縮短了肝纖維化（硬化)形成時間，早期肝纖維化4~6周形成，8~10周形成肝硬化。動物死亡率仍在40%左右。

3．復合因子干預造模：采用高脂低蛋白食物，30%左右的酒精為唯一飲料，皮下注射CCl₄（第1次0.5ml/100g體重，以后每隔3天注射40%CCl₄油劑0.3ml/100g體重)。實驗第6周末可形成肝硬化。該模型方法簡單，肝硬化形成率高，動物死亡率低。

（二)致癌劑N-乙基亞硝胺（DEN)、二甲基亞硝胺（DMNA)、硫代乙酰胺（TAA)誘發(fā)肝纖維化（硬化)模型：

DEN、DMNA是一種具有肝毒性、細胞毒性和免疫毒性的化合物。

DMNA造模方法為腹腔注射，腹腔每周注射DMNA3次，處理3周，結果17天即可見肝小葉中央?yún)^(qū)肝細胞壞死及嗜中性細胞浸潤，21天可見膠原纖維沉積、局部脂肪變、膽管增生，中央靜脈周圍纖維沉積，此模型與人類肝硬化早期改變的膠原纖維沉積相似，可作為篩選抗纖維化藥物的方便模型。
TAA制備模型的原理是TAA入肝后延長肝細胞有絲分裂過程，并阻礙RNA從胞核到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移，進而影響依賴酶的代謝過程，最終形成肝細胞壞死。肝實質(zhì)的破壞引起間質(zhì)內(nèi)織締組織的生成增多，從而引起纖維組織在局部的沉積，其形成的動物模型在血流動力學、形態(tài)學及功能上的改變均與人肝硬化相似。具體方法為用雄性wistar大白鼠，體重130克左右。第一次20mg/100g體重，從第二次起12mg/100g體重，用液體石蠟、橄欖油將CCl₄配成40%的溶液每周2次腹腔內(nèi)注射；或飲水中加入0.03%TAA，3個月后100%形成肝硬化，動物死亡率約20%。

二、酒精中毒性和營養(yǎng)性肝纖維化（硬化)模型

酒精引起肝纖維化的主要機制是：酒精中間代謝產(chǎn)物乙醛對肝臟產(chǎn)生直接損害，其在肝臟使輔酶Ⅰ（NAD)轉(zhuǎn)變?yōu)檫�原性輔酶Ⅰ（NADH)，從而其比值下降，而NAD／NADH比值下降使三羧酸循環(huán)受抑制，進而脂肪氧化減弱，肝內(nèi)脂肪酸合成增多，當其增多超過肝臟的處理能力就形成脂肪肝，最終形成肝纖維化。

河福金等在大鼠常規(guī)喂養(yǎng)同時灌入酒精（56℃)、橄欖油等的混合液，4周后可見肝小葉中央?yún)^(qū)明顯壞死或呈局灶性壞死、點狀壞死，間質(zhì)可見炎性浸潤，電鏡下可見肝細胞周圍膠原纖維增生，此類模型可廣泛用于酒精性肝病的研究，依其處于不同的時期可作酒精性脂肪肝及肝纖維化的研究.主要缺點是缺乏穩(wěn)定。

丁霞等采用雄性Wistar大鼠，180~200g體重，每天清早用白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃，另外間斷給予高脂飼料（其中酒精攝入量為8~12g/Kg·d，玉米油為2g/Kg·d，吡唑為24mg/Kg·d)，造模時間為12周�？梢姴煌�類型的變性、壞死及膠原纖維增生，均有肝纖維化形成，但程度不一。

三、免疫性肝纖維化（硬化)模型

1．用異種血清制品建立肝纖維化模型：其主要原理是異種血清進入體內(nèi)引發(fā)機體免疫應答反應，在肝臟主要是在門脈匯管區(qū)及中央靜脈周圍形成免疫復合物沉積，由沉積的免疫復合物引起局部炎性反應，進一步刺激膠原的增生而形成肝纖維化，并見匯管區(qū)主要分布肌成纖維細胞。

方法為：雄性Wistar大鼠，體重120~150克。尾靜脈攻擊注射異種人血清白蛋白，2次/周，第一周2~3mg/只，以后每次攻擊增加0.5mg，直至4.5mg。維持此量，至少2月。攻擊后60天纖維化達到最大限度且纖維化持續(xù)時間達260天以上。肝纖維化形成率約為85%。建立免疫性肝纖維化（硬化)動物模型，對于研究肝纖維化（硬化)的產(chǎn)生機制、早期診斷及評價藥物療效，是一種極有用的肝纖維化模型。

2．用細菌菌體成份建立肝纖維化模型：大鼠腹腔內(nèi)注射鏈球菌胞壁提取物，可引起門脈區(qū)周圍肉芽腫，為T細胞依賴性免疫應答損傷所致的肝纖維化，可用于研究肝纖維化過程中巨噬細胞、T細胞及其它細胞及這些細胞產(chǎn)生的細胞因子的作用。

四、總膽管結扎致肝纖維化（硬化)模型

其作用原理是形成人為的肝外膽道梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴張、膽汁淤積、膽道內(nèi)壓力增高，并可引發(fā)肝內(nèi)膽小管擴張破裂，由于肝內(nèi)血管受到擴張膽管的壓迫及膽汁外滲，肝細胞會發(fā)生缺血和壞死，纖維組織向膽管間伸展，包圍肝小葉并散布于肝細胞周圍，最終形成肝硬化。

動物選用健康的成年雜種狗，雌雄均有，體重12~21Kg。術前禁食12小時，戊巴比妥30mg/Kg靜脈麻醉，上腹正中切口，分離總膽管2~3cm，近十二指腸處和近膽囊處各扎兩道，從中切斷膽總管。6~10周即可建立肝纖維化（硬化)模型。

由于造成的是完全性梗阻，所以建立模型的時間相對較短。該模型的肝功能試驗異常及病理組織學所見，與人類小結性肝硬化的生化及組織學變化相似。

五、生物學模型

（一)蟲卵致肝纖維化（硬化)模型

小鼠、家兔等動物感染血吸蟲所致的肝纖維化（硬化)模型，病變特殊，可用于研究血吸蟲病性肝纖維化（硬化)，但不適于其他類型的肝纖維化（硬化)。

小鼠皮下注射曼氏血吸蟲尾蚴后，門脈區(qū)寄生蟲卵沉積引發(fā)免疫反應產(chǎn)生炎癥，6~8周肝纖維化形成，10~20周后形成肝硬化。肝臟膠原量可增加至正常的20倍，白蛋白合成也受抑制。

（二)病毒致肝纖維化（硬化)模型

我國的肝纖維化大都繼發(fā)于病毒性肝炎。因此，用鴨乙肝病毒（DHBV)感染鴨來制作病毒性肝炎肝纖維化（硬化)模型，有益于對病毒性肝炎肝纖維化（硬化)的肝纖維化機制和藥物治療的研究。

造模成功與否的主要因素有：（1)鴨種：北京鴨較為敏感。（2)DHBV接種劑量：7.5×10⁷~5×10⁹之間。（3)接種途徑：包括靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、胚內(nèi)注射，其中靜脈注射感染率可達100%。（4)接種時機：孵出后24小時內(nèi)接種最佳，此時，鴨免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善。

方法舉例：60~90g體重的1日齡櫻桃谷鴨（英國鴨與北京鴨雜種)，經(jīng)脛靜脈注射鴨乙肝病毒0.1ml/只（含DHBV顆粒2.5×10⁹)。80天可見纖維組織輕度增生，100天纖維組織中度增生，112天約10%發(fā)生肝纖維化，約5%發(fā)生肝硬化。

（三)復合因素所致肝纖維化（硬化)模型

由于單因素造模時間長，成模率低，單一因素加大劑量不能提高肝纖維化水平，反而動物死亡率增高；復合因素造模，時間短，成模率高。

有CCl₄與乙醇聯(lián)合使用，CCl₄與苯巴比妥、亞硝基胺合用，CCl₄與DMNA合用，乙醇與飽和脂肪酸或植物油、葡萄糖合用等等。如CCl₄與DMNA合用，肝纖維化時間可縮短至42天，且該模型可用于研究肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化的機理。

肝纖維化（硬化)模型種類繁多，理想的肝纖維化模型需要符合以下特征：復制人肝纖維化（硬化)的病變模型；病理改變呈階段性進展；模型制作的可重復性高且死亡率低；肝纖維化應具有可逆性和不可逆性病變過程；病理生理上一系列的病變過程與人類的相似。

總體上動物肝纖維化（硬化)模型能與人的肝纖維化（硬化)有形態(tài)學、血液動力學及生化方面相似的特點，但到目前為止沒有與人肝纖維化（硬化)完全相似的模型，可能與人和動物之間的種屬差異有關，但仍可依據(jù)不同的實驗目的來選取相應的實驗動物模型。

（朱建思)

第七節(jié)  呼吸衰竭動物模型

呼吸衰竭是由導致外呼吸功能發(fā)生嚴重障礙的疾病所引起，也是這些疾病發(fā)生發(fā)展過程中導致病人死亡的重要原因。根據(jù)PaO2降低或PaCO2是否升高，可將呼吸衰竭分為低氧血癥型(Ⅰ型) 和高碳酸血癥型(Ⅱ型) ，按發(fā)病機制不同，可分為通氣性和換氣性呼吸衰竭，因原發(fā)病變部位不同，可分為中樞性和外周性呼吸衰竭，根據(jù)病情的急緩分為急性和慢性呼吸衰竭。呼吸窘迫綜合征（Respiratory distress syndrome,RDS)是臨床上較常見的一型急性呼吸衰竭，于1967年由Ashbaugh首先提出，其臨床特征為：進行性的呼吸困難和低氧血癥，常繼發(fā)于休克、創(chuàng)傷、燒傷、膿毒血癥、氧中毒等多種病理過程。目前，利用實驗動物復制RDS模型的方法有多種，如給予動物靜脈注射油酸、甘油三脂、內(nèi)毒素或吸高濃度氧、失血性休克等，本節(jié)主要介紹一種用動物異體骨髓提取液靜脈注射的方法復制RDS模型。

一、動物

大鼠、家兔、家犬、豬等動物均可用于復制RDS模型，且不拘雌雄和品系，因大鼠和家兔體格小，提取骨髓較麻煩，而從家犬和豬提取骨髓較容易。

二、方法

（一)犬骨髓提取液的制備：

取犬新鮮長骨，刮除骨膜外組織，75%乙醇消毒后劈開。將劈開的長骨放入乙醚中洗出骨髓腔的骨髓，然后，用普通濾紙過濾，清除碎骨和組織等有形成份。骨髓與乙醚混合物放于燒杯中，加蓋濾紙防塵，在常溫下乙醚經(jīng)48小時充分揮發(fā)后，得清亮微黃骨髓提取液，置冰箱備用。豬骨髓提取液制備方法與此相同。

（二)模型復制步驟

1．選取健康雜種犬或小型豬，體重4~8kg左右，雌雄不拘，以3%戊巴比妥鈉1ml/kg靜脈麻醉。頸部手術, 作氣管插管, 分離頸總動脈和頸外靜脈。

2．從右側頸外靜脈插入漂浮導管經(jīng)右心房、右心室至肺動脈以備測肺動脈楔壓(PAP)，從左側頸總動脈插入普通導管至主動脈以備測主動脈壓(Aorticpresure，AP)。

3． 從左側頸外靜脈注入加溫至38^．C的骨髓提取液，注射量按0.6ml/kg計算。緩慢注射歷時1~2分種左右。

4． 注射骨髓提取液前后，全程監(jiān)測主動脈壓和肺動脈楔壓。每小時測一次主動脈血pH 、Pa O_{2 、} 和PaCO₂  并計算肺泡－動脈氧分壓差(A-aDO₂)。

（三)模型復制結果判定

1．呼吸變化

 動物在靜脈注入骨髓提取液后，10分鐘內(nèi)均表現(xiàn)出呼吸加深加快，1小時后，呼吸頻率可達正常頻率的3~4倍，3小時后呼吸頻率開始趨緩，可有明顯的吸氣性呼吸困難。

2．血氣和A-aDO₂ 變化

靜脈注入骨髓提取液后，PaO₂開始逐漸下降，1小時后 PaO₂可低于60mmHg，而pH與PaCO₂無明顯變化，但可見pH稍偏高，PaCO₂稍偏低。A-aDO₂ 正常值在海平面呼吸空氣的條件下為10~30mmHg，差值增大說明肺泡氧彌散功能發(fā)生障礙，這是判定RDS的主要依據(jù)。RDS時因肺水腫、充血、出血等病變使肺通氣/血流比值改變，導致的嚴重低氧血癥不能單純用提高吸入氧分數(shù)(FiO₂) 糾正。

A-aDO₂計算公式：

  A-aDO₂=［（大氣壓－水蒸氣壓)×吸入氣氧濃度－（PaCO₂÷呼吸商)］－PaO₂＝

［（760－47)×0.21－（40÷0.8)］－PaO₂＝98－PaO₂    

3．PAP與AP

靜脈注入骨髓提取液后，PAP快速升高并持續(xù)穩(wěn)定在較高水平，3小時后再次開始緩慢升高。AP無明顯變化。

4．肺病理形態(tài)變化

肺體積和重量增加使肺系數(shù)增大［肺系數(shù)＝肺重量(g)÷體重(kg) ］。鏡檢可見肺水腫、肺出血、微血栓、肺間質(zhì)炎性浸潤和增厚、肺透明膜形成。部分肺泡萎陷，部分肺泡呈代償性擴張。

骨髓提取液中含有軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、豆冠酸、花生酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等成分，此外，還有一些未測成分。用骨髓提取液復制RDS模型，在發(fā)病原因上較單純用油酸、甘油三酯更接近于嚴重擠壓傷或骨折時機體大量釋放脂質(zhì)所致RDS，其引起RDS發(fā)生發(fā)展的主要機制為骨髓栓塞肺毛細血管造成肺微循環(huán)障礙。

  (金海燕)

第八節(jié)  多器官功能障礙綜合征動物模型

多器官功能障礙綜合征（MODS)主要是指嚴重創(chuàng)傷、感染、休克期間或復蘇后，同時或者相繼出現(xiàn)兩個或兩個以上器官功能障礙。在MODS發(fā)病過程中還出現(xiàn)失控的全身炎癥、高代謝狀態(tài)、高動力循環(huán)等全身炎癥反應綜合征（SIRS)及免疫功能失調(diào)。MODS可以逆轉(zhuǎn)，并且可以不遺留器官損傷的痕跡，也不復發(fā)。但迄今為止其發(fā)病機制仍不清楚，早期診斷較為困難，缺乏行之有效的防治手段，發(fā)病率和病死率居高不下。因此，闡明MODS的概念和發(fā)病機制，找出早期診斷的指標和防治方法，具有重要的理論價值和實踐意義。

一、單向速發(fā)型MODS動物模型

（一)實驗目的

模擬多器官功能障礙綜合征（MODS)的致病因素、發(fā)病過程和臨床特征，研究MODS的發(fā)病機理及其防治措施

（二)實驗動物

Wistar大鼠，200~300克，性別不拘。

（三)藥品、器材

酵母多糖粉劑（zymosan A,Sigma公司)、醫(yī)用石蠟、3%戊巴比妥鈉、無菌生理鹽水、無菌林格氏液等。高頻磁力攪拌器，注射器等。

含酵母多糖石蠟液的配制：將酵母多糖粉劑1克加入20毫升醫(yī)用石蠟中，用高頻磁力攪拌器混勻制成懸液，置100^oC水浴中消毒后備用。

（四)實驗步驟

動物分為三組，實驗組、石蠟對照組和正常對照組。實驗組動物腹腔注射含酵母多糖石蠟液1.5~2ml /100g體重，石蠟對照組動物腹腔注射醫(yī)用石蠟液1.5~2ml /100g體重，正常對照組動物腹腔注射無菌生理鹽水1.5~2ml /100g體重。實驗組與石蠟對照組動物于實驗第一天腹腔補充無菌生理鹽水10ml /100g體重，第二天補充5ml /100g體重，第三天及第四天分別補充2.5~1.25ml /100g體重。分別于第二天和第五天放血或斷頭處死動物，處死前左心室取血檢測PaO₂ 、GPT、 Cr，處死后取主要臟器作大體檢查和常規(guī)石蠟切片作光鏡檢查，必要時作常規(guī)透射電鏡制樣，用作超微結構觀察。

（五)結果判定

注射酵母多糖動物第2天，平均動脈壓明顯降低，尿量顯著減少，血肌酐及谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，嗜睡、反應低下，門靜脈和肝靜脈血培養(yǎng)陽性率顯著高于對照組；具有明顯SIRS的表現(xiàn)，病理改變主要為各臟器組織水腫、出血和炎癥細胞浸潤，可見實質(zhì)細胞變性、壞死、脫落，部分動物在2天內(nèi)死亡。至第5天，上述病變有所減輕。

此模型較易復制，死亡率較低（33%左右)，有明顯的SIRS和多器官損害。其中以肺臟發(fā)生最早、最嚴重。但致病因素與臨床有一定差距。本模型適用于發(fā)病機制研究。

二、雙相遲發(fā)型MODS動物模型

（一)鼠雙相遲發(fā)型MODS模型

1．實驗目的

模擬多器官功能障礙綜合征（MODS)的致病因素、發(fā)病過程和臨床特征，研究MODS的發(fā)病機理及其防治措施。

2．動物與分組

Wistar大鼠，體重200~300克，性別不拘。

3．藥品、器材

大腸桿菌內(nèi)毒素（E.Coli O₅₅B₅)，3%戊巴比妥鈉，無菌林格氏液，動、靜脈插管，輸血、輸液器材，注射器等。

4．實驗步驟

動物術前12小時禁食，戊巴比妥鈉3mg /100g體重腹腔麻醉。行一側頸動、靜脈分離與插管，動脈插管用于檢測血壓和放血。動物分為三組，首次打擊組采用失血性休克和再灌流損傷。按Wigger’s法在3分鐘內(nèi)快速放血，使平均動脈壓迅速降至4kPa (30mmHg ),然后緩慢放血，使平均動脈壓維持在4~4.7kPa (30~35mmHg )，持續(xù)2小時。之后將全部放出的血液及其1倍容量的林格氏液經(jīng)頸靜脈快速回輸（15分鐘內(nèi)完成)，造成缺血-再灌注損傷。首次加第二次打擊組在復蘇后6小時實施第二次打擊。第二次打擊組不作前述處理，僅從腹腔1次性注射大腸桿菌內(nèi)毒素（E.ColiO₅₅B₅)2mg /100g體重，造成腹膜炎和膿毒癥。注射后4小時，經(jīng)腹腔補充林格式液5ml/100g體重。整個實驗觀察72小時。

5．結果

動物有SIRS表現(xiàn)，首次加第二次打擊組心、肝、腸等臟器功能障礙發(fā)生率約為50%，死亡率大于30%，而首次打擊組和第二次打擊組基本不出現(xiàn)MODS。

本模型損傷因素和發(fā)病過程均與臨床接近，適合于SIRS或雙相遲發(fā)型MODS機理及防治方面的研究。

（二)標準化的MODS模型

1．實驗動物

1年齡的雄性山羊，體重25公斤左右。

2．藥品、試劑

大腸桿菌內(nèi)毒素（O₂₆B₆), 3%戊巴比妥鈉，林格式液，10%脂肪乳劑和葡萄糖液，復合氨基酸等。

3．動物ICU的建立

基本設備：1)心功能監(jiān)護儀：能進行全套血流動力學監(jiān)測  2)多功能呼吸機：能監(jiān)測呼吸頻率、潮氣量、氣道阻力、肺順應性、吸入氧濃度，并具備PEEP功。 3)輸液泵和注射器泵：用于循環(huán)治療。4)氧氣管道用于氧療。5)負壓吸引裝置，用于吸痰和胃腸減壓。6)動物代謝籠和動物固定裝置。7)具有空調(diào)、凈化和通風設備。

4．實驗步驟

模型復制分為受次打擊（手術創(chuàng)傷+失血性休克+復蘇再灌流)、二次打擊（門靜脈內(nèi)毒素血癥)和器官支持三個階段。動物分為首次打擊組、二次打擊組、首次+二次打擊組。山羊用戊巴比妥鈉30mg/kg體重腹腔麻醉，頸部手術行氣管插管、頸總動脈、頸靜脈和肺動脈插管。上腹正中切口，自腸系膜上靜脈插管至門靜脈，監(jiān)測門靜脈血流量（PVF)，作胃和回腸造瘺置入胃腸粘摸張力計監(jiān)測胃和小腸粘摸pH (pHi )；首次打擊組術后20分鐘采用Wiggers法造成失血性休克，平均動脈壓維持在6.0~7.3kPa 1小時。之后經(jīng)靜脈和門靜脈快速輸回放出的血液及其2倍容量的林格氏液。此時，MAP和心臟指數(shù)（CI)均能恢復至休克前的80%以上；第二次打擊組于復蘇后24小時經(jīng)門靜脈持續(xù)輸入大腸桿菌O₂₆B₆內(nèi)毒素30ng /kg·min ，持續(xù)5天。

器官功能監(jiān)護和支持：進行持續(xù)呼吸和循環(huán)功能監(jiān)護，當心血管或/和呼吸功能不全達到1分（見后)時，施行機械通氣或/和輸入多巴胺維持血壓。整個實驗過程進行代謝監(jiān)測和標準代謝支持，熱卡按2倍基礎能量消耗（山羊?qū)崪y為85.8±3.9k/kg.·d)，靜脈輸入復合氨基酸、10%脂肪乳劑和葡萄糖溶液補給。補充蛋白質(zhì)1.45g /kg·d，熱卡與氮的比例為2180：1，常規(guī)補鉀1。5/d ，水100~150ml/kg·d。

   5．檢測指標

（1)炎癥介質(zhì)：測定TNF、IL-6、IL-8等；

（2)器官功能：測定血氣和心、肝、腎以及血液酶學或生化指標；測定門靜脈血二胺

氧化酶（DAO)、小腸pHi以及尿中乳果糖與甘露醇排除量的比值作為評價腸屏障功能的參考；

（3)血細菌培養(yǎng)、內(nèi)毒素測定和臟器細菌定量：

（4)物質(zhì)代謝：測定血葡萄糖、游離脂肪酸、尿三甲基組氨酸和全血乳酸含量；

（5)血流動力學：用心功能監(jiān)護儀測定并計算體循環(huán)、肺循環(huán)和門靜脈血流動力學和氧代謝指標；

（6)病理形態(tài)學檢查：

本模型為標準化的MODS動物模型，最大限度地模擬臨床MODS的病因、發(fā)病過程和功能、代謝變化，是研究MODS發(fā)病機制及其防治的好的動物模型。

表15-2 動物SIRS的診斷依據(jù)

表16-3 動物MODS時器官功能障礙分期診斷及評分標準

 注：P（A-a)O2:肺泡動脈氧分壓差；pHi：粘膜內(nèi)pH值；L/M：尿中乳果糖與甘露醇排出量的比值；FENa；濾過鈉排泄分數(shù)；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶

（馮大明)