RIA中放射性碘標記

　　4．放射性比活度及其測定

　�。�1)放射性比活度簡稱比活度，過去也稱比放射性。

　　比活度＝放射性活度／單位化學(xué)量

　�。�2)比活度的理論值計算：每種放射性核素有一個比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數(shù)。若N是1毫克原子（1mA)的總原子數(shù)，衰變常數(shù)λ（單位時間衰變的%)，則

　　任何元素每1mA的原子數(shù)都相同，等于阿伏加德羅常數(shù)，即6.023×10²⁰個，故

　　若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進行單位換算后為：

　　根據(jù)上式，可計算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2)。如果標記化合物每分子接上一個放射性核素原子，則以上原論值亦為該標記化合物的比活度（每毫摩爾的活度)理論值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值

　�。ㄒ嗉疵糠肿右唤右粋�該放射性核素原子的標記化合物的經(jīng)活度理論值)

　　(3)放射性比活度測定方法

　�、僦苯訙y定計算法：將標記產(chǎn)品經(jīng)分離純化后，配成合適的溶液，測定每毫升的放射性活度（如mCi/ml)及含量（μg/ml)從而計算其比活度。對于高經(jīng)活度的標記物，化學(xué)含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測定其含量。

　�、趯游鰭呙杳娣e計算法：一般應(yīng)用紙層析或薄層層析，將反應(yīng)結(jié)果尚未分離的反應(yīng)液點樣、展層，然后在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據(jù)描繪的面積來進行計算，如圖8-4。

圖8-4　放射層析掃描面積計算比活度示意圖

₁為標記物峰面積：

S₂S₃為雜質(zhì)峰及放射性原料峰面積

　　先計算標記率：

　　放射性比活度的計算：若投入的待標記物重量為W，且100%轉(zhuǎn)化為標記物，則比活度=A·Y/W，其中A為投入的總放射性。

　　如果層析掃描儀有紫外監(jiān)測器和放射性活度計數(shù)率儀可同步測定掃描，則直接可給出比活度。

　�、圩陨砣〈�計算法：這是間接測定標記物比活度的方法。所測定的標記物，需是分離純化后可用于RIA或RRA標記試劑。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

　　方法的原理是：作一條常規(guī)的RIA（或RRA)標準曲線，另作一條不加非標記標準品，只加抗體和不同量標記試劑的自身取代曲線。兩者用同一種抗體，且抗體用量完全相同。若反應(yīng)平衡后測定結(jié)合部分的放射性，掏算成所加總放射性（注意：對標準曲線總說總放射性各管相同，對自身取代曲線來說各管不同，需分別換算)的百分數(shù)，即結(jié)合率B。由于兩條曲線所用抗體的質(zhì)和量嚴格相同，標記物與非標記標準品與抗體親和力也相同，故B的大小就完全取決于各管中標記物和非標記標準品的總量。亦即若從兩標準曲線上取一點相同的B，則

　　（標記物+標準品)_標準曲線=（標記物)_{自身取代曲線}

　　故由此便可直接計算標記試劑的化學(xué)含量并進一步求得比活度。為求準確度高，可取我點B求出平均比活度。

　　用自身取代法測定標記化合物的比活度，只適用于RIA的標記抗原及受體的標記配基。使用時應(yīng)注意：①標記物與未標記物對抗體（受體)的親和力應(yīng)相同；②非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計算時應(yīng)扣除；③制備標準曲線與自身取代曲線時，操作步驟應(yīng)相同，特別是B與F分離的條件要一致。

　　5．生物活性、免疫活性測定

　�。�10)生物活性、免疫活性測定的重要性：放射性標記化合物作為示蹤劑用于生物體內(nèi)的示蹤研究，或作為分析試劑用于生物活性物質(zhì)分析，都要求標記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當給化物引入放射性原子，即使“同位素標記”大多需經(jīng)過原子交換或化學(xué)反應(yīng)及分離純化等物理化學(xué)處理，有可能造成光學(xué)構(gòu)型及立體構(gòu)型的改變而使標記物改變性質(zhì)�！胺峭�位素標記”，如蛋白質(zhì)分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質(zhì)失活、變性。故測定放射性標記化合物的生物活性和免疫活性，對保證使用效果十分必要。

　�。�2)生物活性和免疫活性測定的要求：需根據(jù)使用要求而定，因為同一標記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關(guān)；同一標記激素，其與受體結(jié)合能力的改變與抗體結(jié)合能力的改變也不一定平行。

　�。�3)測定方法：測定標記蛋白質(zhì)或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：

　�、傥锢砘瘜W(xué)方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過濾法等物理化學(xué)方法來測定標記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變情況，如標記后受損全傷的蛋白質(zhì)在電泳時泳動性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質(zhì)也有改變，而蛋白質(zhì)變性聚合時大分子聚合體將在凝膠過濾時不停留在凝膠柱上。這些測定雖較快速方便，但對標記物的生物活性和免疫活性的嚴格判定來說，還是很不夠的。

　�、谔禺惤Y(jié)合試驗：根據(jù)放射性標記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應(yīng)抗體或受體進行特異性結(jié)合試驗。以放射免疫分析試劑為例，測定其免疫活性的方法是：先觀察標記物與抗體的結(jié)合率，如果結(jié)合率高，說明抗原的免疫活性較好。進一步觀察標記抗原與非標記對抗體親合力是否一致，做法之一是用不同稀釋度的抗體，分別與標記抗原及與標記抗原加非標記抗原的混合物進行特異結(jié)合，其中混合物抗原總濃度要和單獨使用放射性抗原的濃度相同。如單獨使用標記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng，非標記抗原為0.9ng，比較兩者的結(jié)合率，如果基本相同，說明標記抗原保持其原來的親和力，在標記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。

圖8-5　標記蛋白的免疫活性測定

　　A；為標記抗原與血清的滴度曲線B：為非標記抗原（加入少量標記抗原)的滴度曲線；C：與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低

　�、凵�物特性測定：如¹²⁵I—纖維蛋白原，可用凝血酶測定其可凝能力，與非標記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測定，根據(jù)標記物的生物性質(zhì)而定。另外，上述特異性結(jié)合試驗，如果受體作異結(jié)合劑，也是檢驗用作RRA或RBA分析試劑的標記物生物活性情況的有效方法。

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