（四)�；噭˙olton和Hunter試劑)法
1．原理這個(gè)方法用�；瘎�3--（4-羥苯基)丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑)做連接試劑，將125I標(biāo)記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個(gè)酰氨鍵將3--（4—羥基—5—125I—苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。
2．方法125I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時(shí)取一定量的標(biāo)記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標(biāo)記酯)，用氮?dú)獯党�，投入欲�?biāo)記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應(yīng)15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸)，使過量標(biāo)記酯消耗掉以終止反應(yīng)。
此法避免了蛋白質(zhì)與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的損傷，適用于標(biāo)記缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會(huì)引起蛋白質(zhì)的失活。其缺點(diǎn)是標(biāo)記技術(shù)比較復(fù)雜，需要接觸較多的放射性，經(jīng)二步反應(yīng)，碘標(biāo)記率比較低。一般認(rèn)為此法不宜標(biāo)記短肽，而適于分子量大于1萬(wàn)的蛋白質(zhì)。
三、放射性標(biāo)記化合物的純化與鑒定
（一)純化標(biāo)記化合物的常用方法
不論使用何種制備方法，要獲得合格的標(biāo)記化合物，都必須將反應(yīng)物經(jīng)過仔細(xì)的分離、純化。另外，一些標(biāo)記化合物，經(jīng)過一定時(shí)間的存放后，往往會(huì)出現(xiàn)不純物，而需再純化。如碘標(biāo)記生長(zhǎng)激素（125--HGH),在剛標(biāo)記的第2天，從Sephadex G-100過濾譜上可見，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個(gè)月后，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標(biāo)記生長(zhǎng)激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學(xué)雜質(zhì)（圖8--3)。
圖8－3 125I—HGH的Sephadex G-100過濾譜
實(shí)線：新鮮制備的 125I—HGH 虛線：保存1個(gè)月的125I—HGH
標(biāo)記化合物的純化方法，除制備比活度低而化學(xué)量又較多的標(biāo)記物可用重結(jié)晶、蒸餾、萃取等常規(guī)方法外，一般需用微量分離技術(shù)，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過濾及高效液相層析法等�，F(xiàn)以碘標(biāo)記蛋白為例，說(shuō)明以上各種方法的適用情況。
1．凝膠過濾法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分離標(biāo)記蛋白與無(wú)機(jī)碘時(shí)，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100進(jìn)一步純化。
2．離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化短肽標(biāo)記物。
3．透析法 能將標(biāo)記蛋白與小分子化合物很好地分離。
4．電泳法可用來(lái)分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質(zhì)。
5．親和層析法利用蛋白質(zhì)與其特異抗體或受體的結(jié)合來(lái)分離、純化標(biāo)記蛋白質(zhì)。此法特異性強(qiáng)，保持生物活性好，但操作較復(fù)雜。
6．高效液相層析法此法最大優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、快速，但需特殊設(shè)備。
7．伴刀豆球蛋白A（ConA)吸附法ConA是一種植物凝集素，對(duì)糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標(biāo)記糖蛋白。吸附的標(biāo)記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。
（二)標(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo)
作為示蹤劑及分析試劑的標(biāo)記化合物，應(yīng)具有比一般非標(biāo)記化合物更高的質(zhì)量要求。標(biāo)記化合物的質(zhì)量指標(biāo)包括：放射性核純度、放射化學(xué)純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標(biāo)記位置和定量分布情況等。
1．放射性核純度及其檢查方法
�。�1)放射性核純芳可用下式表示：
放射性核純度（%)=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100
（2)放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線能量，故可通過半衰期及射線能量的測(cè)定來(lái)鑒別所需放射性核的純度。
�、贉y(cè)定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時(shí)間跟蹤法，每隔一定時(shí)間測(cè)量放射性一次，共測(cè)3～5個(gè)半衰期，以每次測(cè)得的放射性計(jì)數(shù)為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上作圖，并通過分析，可求出該放射性核素的純度。
�、跍y(cè)定射線能量法：利用每一放射性核素的特征射線譜來(lái)檢查放射性核純度。γ發(fā)射體可用γ能譜儀，如檢測(cè)57Co和58Co的核純度：純?chǔ)?發(fā)射體可用液閃儀，調(diào)節(jié) 道寬及淬火校正后，對(duì)如3H、14C、32P的核純度進(jìn)行測(cè)量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測(cè)量，如99mrTc中母體雜質(zhì)99mMo的含量測(cè)量，是通過適當(dāng)厚度的鉛屏蔽，將99mTc 發(fā)射的能量為141ke V的γ射線減弱后，測(cè)定99Mo發(fā)射的能量為739Kev 的γ射線。
2．放射化學(xué)純度及放化純度鑒定
�。�1)放射化學(xué)純度：放射性核素標(biāo)記化合物都是以一定的化學(xué)形態(tài)存在的，所以：
放射化學(xué)純度（%)特定化學(xué)形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度×100
放射化學(xué)純度受制備方法及原料的化學(xué)純度、產(chǎn)物存放條件等影響，一般放化純度控制在95%以上。
�。�2)放射化學(xué)純度的測(cè)定方法：原則是高效的化學(xué)分離與靈敏的放射性測(cè)量相結(jié)合。常用下列方法：
�、俜派鋵游龇�，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術(shù)使混合物中各組份分離，然后測(cè)定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。最常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。
�、诜派湫愿咝б合鄬游龇ǎ核鼘�(duì)分離純化標(biāo)記化合物及鑒定標(biāo)記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點(diǎn)（幾乎80%的有機(jī)化合物均可應(yīng)用)。關(guān)鍵是要選擇合適的固定相和流動(dòng)相，使產(chǎn)品與雜質(zhì)分離。在流動(dòng)相中，被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)，而其放射性活度，可同時(shí)由放射性探測(cè)儀測(cè)定。放射性活度測(cè)定最簡(jiǎn)單的一種辦法，是將洗脫液分部收集，然后在γ儀或液閃儀上進(jìn)行測(cè)量；另一種較理想的是連續(xù)測(cè)量，在洗脫液流通池外包圍一個(gè)固體閃爍探頭，進(jìn)行γ計(jì)數(shù)或在流通池前加一個(gè)三通混合室，用另一個(gè)泵混入閃爍液，測(cè)定軟β射線�？梢耘c紫外控測(cè)器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。
③放射性核素反稀釋法：取一定量（W1)已測(cè)定比活度（SO)的標(biāo)記化合物（約0.1～10mg)，用>1000倍化學(xué)量（W2)的純載體稀釋，充分混勻后反復(fù)純化到比活度恒定不變（Sp)，此標(biāo)記化合物的放化純度值應(yīng)為：
有時(shí)該值>100%時(shí)，往往是由于所用載體化學(xué)純度不夠。因本法操作要求嚴(yán)格，一般不作常規(guī)放化純度鑒定用。
3．化學(xué)純度及化學(xué)量的測(cè)定標(biāo)記化合物中的非放射性化學(xué)雜質(zhì)雖一般不會(huì)對(duì)示蹤結(jié)果帶來(lái)直接干擾，然而這種雜質(zhì)的含量越多對(duì)標(biāo)記化合物在使用、存放過程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發(fā)現(xiàn)某些標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)給使用帶來(lái)直接影響。如用氚標(biāo)記類固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)影響標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率，使分析靈敏度降低。因此，對(duì)標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)含量，同樣必須加以控制。
要制得化學(xué)純度的標(biāo)記化合物，最好是對(duì)可能產(chǎn)生的雜質(zhì)加以防止。這要在冷試驗(yàn)中解決。因?yàn)槔湓囼?yàn)所得產(chǎn)品是非放射性的，其化學(xué)純度可用常規(guī)方法，如溶點(diǎn)、沸點(diǎn)測(cè)定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產(chǎn)品后，再按同樣方法及條件進(jìn)行標(biāo)記制備。
對(duì)于標(biāo)記化合物的化學(xué)含量，則必需在標(biāo)記反應(yīng)及一定純化步驟后進(jìn)行，由于需要高比活度的標(biāo)記化合物，往往樣品的放射性很強(qiáng)，而化學(xué)量極微（如某氘標(biāo)記化合物，分子量為300，每分子上標(biāo)記2個(gè)氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq)的化學(xué)量還不足（130μg),所以需用微量分析法才能測(cè)定其含量。一般而言，各種常規(guī)微量分析技術(shù)均可應(yīng)用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進(jìn)行含量測(cè)定。
