常用的標(biāo)記方法有：
�。ㄒ�)氯胺T法
氯胺T法標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑便宜易得，是目前使用最多的碘標(biāo)記方法。
1．原理氯氨—T（Chloramine--T)是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個或兩個氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。
2．方法以125I—AVP的制備為例。
�。�1)碘化反應(yīng)：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5)+1251800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振蕩混勻，室溫下反應(yīng)40s。
�。�2)終止碘化反應(yīng)：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以終止碘化反應(yīng)。
�。�3)Bio—Gel P2層析純化：將碘化反應(yīng)混合液注入Bio—Gel P2柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。
（4)放射性測量：測定各收集管的放射性，出現(xiàn)兩個峰，第一峰為125I—AVP，第二峰為游離碘鹽峰。第一個峰中計(jì)算最高的幾管，留下備用。
為了解標(biāo)記抗原的質(zhì)量，每次碘標(biāo)記后應(yīng)計(jì)算出碘的利用率，標(biāo)記上多少放射性碘，以及每微克抗原結(jié)合上多少放射性碘。
�。�5)標(biāo)記抗原的貯存：經(jīng)純化與檢查后的標(biāo)記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存?zhèn)溆�，�?yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)記抗原在貯存中是不穩(wěn)定的，這是因?yàn)椋阂皇敲摰猓瑯?biāo)記的碘從原來位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長柱（40～80cm )過柱，洗脫后出現(xiàn)3個峰。第1個峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離125I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離125I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，其性能類似于新鮮標(biāo)記的抗原。分離純化的方法解決了標(biāo)記抗原的貯存、長期使用問題，特別對來之不易的抗原更顯得重要。
2．注意事項(xiàng)
（1)放射性碘源的選用：無載體的131I或125I均可用于碘化標(biāo)記，但應(yīng)盡量選用新鮮的、比放射強(qiáng)度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強(qiáng)度最好≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運(yùn)輸保存所需加入)量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強(qiáng)度降低，另一方面因水的輻射化學(xué)產(chǎn)物增多（主要是131I源)，都會降低標(biāo)記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na2S2O5等)量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標(biāo)記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護(hù)和除污染，以及減少射線對蛋白質(zhì)分子的損傷，標(biāo)記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。
�。�2)放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例：這比例對標(biāo)記結(jié)果的影響很大。如上述原因，一般標(biāo)記時放射性投入量不宜過多，示蹤實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標(biāo)記時投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來控制。當(dāng)投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質(zhì)用量多（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低)，能獲得高碘利用率，但所得標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度低；相反多肽、蛋白質(zhì)用量少（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高)，則碘利用率降低，但所得標(biāo)記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當(dāng)此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標(biāo)記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。
�。�3)氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應(yīng)時間：氧化碘化標(biāo)記法中，會導(dǎo)致失活的最主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標(biāo)記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應(yīng)時間較長，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴(yán)重?fù)p傷。氯胺T用量大，或長時間進(jìn)行碘化反應(yīng)，結(jié)果并不能使碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度提高多少，反而使標(biāo)記多肽、蛋白活性下降。當(dāng)用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質(zhì)（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等)作微量標(biāo)記，當(dāng)氯胺T用量為20μg/0.1ml反應(yīng)液、0～20。C反應(yīng)20s，碘利用率都已接近或達(dá)到最大峰，再加大氯胺T用量和延長反應(yīng)時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應(yīng)增加，以達(dá)到預(yù)期的碘利用率，但決不應(yīng)盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應(yīng)時間（通常反應(yīng)時間不要超過1min)，否則會導(dǎo)致標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)嚴(yán)重失活，不能用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎(chǔ)上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標(biāo)記失敗。一般用125I標(biāo)記時，氯胺T用量要適當(dāng)加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標(biāo)記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。
氯胺T用量減少了，Na2S2O5用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)時加入Na2S2O5一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na2S2O5的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此，Na2S2O5用量也不應(yīng)過多。只要藥品沒有變質(zhì)、試劑是新配的，以重量計(jì)算Na2S2O5加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(yīng)（按反應(yīng)克分子濃度計(jì)算，Na2S2O5/氯胺T重量比約0.4)，不要盲目加大用量，并應(yīng)迅速將標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)從反應(yīng)液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。
某些蛋白質(zhì)或多肽對氯胺T較敏感，還可進(jìn)一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應(yīng)時間、降低反應(yīng)溫度，以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標(biāo)記十分重要。
