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中國生物制品規(guī)程:附錄 WHO推薦的白喉類毒素效價測定方法

可選用以下兩種方法之一種進行。(一)Vero細胞測定抗體法1 免疫與采血用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品以2倍稀釋法稀釋成3~5個適當稀釋度,每一稀釋度樣品免疫體重10~14g小白鼠8只,皮下注射0.5ml,f1411.cn/kuaiji/免疫5周后,每個小白鼠采血,分…

可選用以下兩種方法之一種進行。

(一)Vero細胞測定抗體法

1 免疫與采血

用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品以2倍稀釋法稀釋成3~5個適當稀釋度,每一稀釋度樣品免疫體重10~14g小白鼠8只,皮下注射0.5ml,f1411.cn/kuaiji/免疫5周后,每個小白鼠采血,分離血清,56℃30分鐘滅活,放-20℃保存。

2 毒素試驗量測定

Vero細胞測定白喉抗體試驗時毒素試驗量采用Lcd/10000。

在96孔培養(yǎng)板中用RPMI1640(或199)培養(yǎng)液將毒素做2倍系列稀釋,每孔50μl,然后向各孔中加入50μl標準白喉抗毒素(0.0001IU),用膠帶密封,在室溫放置1小時后,加入50μlVero細胞懸液(見3項)密封,放37℃CO2孵箱培養(yǎng)6~7天后,觀察結(jié)果,使細胞死亡的最大毒素稀釋度孔(紅色)就是Lcd/10000。

Lcd/10000的毒素量約相當于1×10-4Lf的毒素適用于本試驗。

3 Vero細胞

RPMI1640(或199)培養(yǎng)液(加青霉素100IU/ml,鏈霉素100μg/ml,胎牛血清10%)。Vero細胞培養(yǎng)于150cm2培養(yǎng)瓶中,待細胞長成占瓶底80%~100%單層時,棄去上層培養(yǎng)液,加10ml0.25%胰酶,放37℃數(shù)分鐘,棄去胰酶,加入10ml培養(yǎng)液,打勻細胞進行計數(shù)(1瓶150cm2培養(yǎng)瓶大約可得10~40×106細胞)。用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2.5×105細胞/ml。

4 陽性對照小白鼠血清

吸附白喉類毒素免疫1批小白鼠,免疫5周后采血,分離血清,分裝小管,冷凍干燥,保存于-20℃。

5 抗體滴定

按下圖將培養(yǎng)板編號:

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12

B1

C1

D1

E1

F1

G1

H1

(1)向每孔加入50μl培養(yǎng)液,但A11、A12和H11、H12孔不加,而G11、G12加100μl培養(yǎng)液。

(2)取8份待檢血清,分別加入A1至H1孔各50μl,橫向進行2倍系列稀釋,直至A10和H10孔。

(3)將標準白喉抗毒素稀釋至0.008IU/ml,加入A11、A12、B11和B12孔各50μl,從B11和B12孔開始豎向做2倍稀釋至D11和D12孔。

(4)H11和H12孔加入陽性小白鼠對照血清50μl。

(5)除G11和G12孔外,向其余各孔中加入毒素(Ldc/10000)50μl,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板,混勻,在培養(yǎng)板上貼上膠帶將板孔封閉,放室溫1小時。

(6)收集Vero細胞,進行計數(shù),并稀釋成2.5×細胞/ml的Vero細胞懸液。

(7)室溫放置1小時之培養(yǎng)板,去膠帶,立即加入50μlVero細胞懸液,再用膠帶封閉培養(yǎng)板,放37℃CO2孵箱培養(yǎng)6天。在24小時及48小時檢查膠帶封閉情況,如出現(xiàn)封閉不嚴應(yīng)更換。

(8)培養(yǎng)6天后取出培養(yǎng)板,根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化記錄結(jié)果,黃色為(+),紅色為(-),羲色不明顯者則可用顯微鏡觀察,如單層細胞完整無損則為(+),否則記錄(-)。最終結(jié)果以打分表示,即變成黃色的最高稀釋度孔的2的指數(shù),例如:變黃的最后一孔是1/256即28,則結(jié)果記為8。

6 試驗要求

E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero細胞敏感度都出現(xiàn)(-),如果出現(xiàn)(+),則毒素量和細胞敏感度都很低,應(yīng)重試。

細胞孔G11、G12和陽性對照孔H11、Hf1411.cn/shiti/12必須是(+),如出現(xiàn)(-),應(yīng)重視。

Lcd/10000毒素量的準確性,根據(jù)以上計劃下列各孔中所加標準抗毒素為:

孔A11和A120.0004IU

B11和B120.0002IU

C11和C120.0001IU

D11和D120.00005IU

如毒素用量準確(Lcd/10000),則A11、A12和B11、B12孔應(yīng)為(+),而C11、C12和D11、D12應(yīng)為(-),否則應(yīng)重試。

7 結(jié)果計算

用平行線分析法進行結(jié)果計算

8 結(jié)果判定

待檢樣品的效價每劑量應(yīng)不少30IU。如95%可信限大于50%~200%,則95%可信限的低限效價應(yīng)大于30IU/1個人用劑量。

(二)豚鼠毒素攻擊法

1 免疫及攻擊

用生理鹽水將吸附白喉類毒素標準品和待檢樣品稀釋成等比間隔的3~5個稀釋度(中間的稀釋度必須在攻毒后能保護約半數(shù)動物),每一稀釋度樣品免疫體重250~300g之豚鼠至少10只,另外5只豚鼠不注射作為對照。免疫后4周,每只免疫豚鼠攻擊白喉毒素100LD50,皮下注射1.0ml。對照組健康動物注射100倍稀釋之上述毒素,每只皮下注射1.0ml。攻擊毒素后觀察5日,每日記錄結(jié)果。

2 試驗成立應(yīng)具備的條件

(1)檢品的最低稀釋度能保護半數(shù)以上動物。

(2)檢品的最高稀釋度保護半數(shù)以下動物。

(3)對照組動物應(yīng)部分死亡而不全部死亡。

(4)檢品和標準品的劑量反應(yīng)曲線在平行性及直線性上沒有太大的偏差。

3 結(jié)果計算及結(jié)果判定

見Vero細胞法7和8項。

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