胃腸道與外界相通,其粘膜表面附著各種細(xì)菌和病毒。粘膜含有各種組織溶解酶,而且胃粘膜呈酸性,www.med126.com腸粘膜偏堿性,因此在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色過程中,必須注意以下幾個環(huán)節(jié) :
免疫細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)就是檢查、鑒定、定位和示蹤組織中各種抗原成分。在組織加工過程中,必須保持抗原的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、抗原性和在組織中的位置保持不變,不引起組織產(chǎn)生自發(fā)熒光及其它非特異性著色。原則上越新鮮的組織越適于進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)研究。
1.組織切片標(biāo)本經(jīng)胃鏡、小腸鏡和大腸鏡等內(nèi)窺鏡取材可以在直視下根據(jù)研究的內(nèi)容在不同部位進(jìn)行取材,即準(zhǔn)確又方便。一般組織塊直徑多在0.5~1.0mm左右,適合進(jìn)行各種抗原的研究。
(1)取材方法:將取材部位調(diào)整到內(nèi)窺鏡視野中央,使活檢鉗與粘膜面垂直,然后鉗取;顧z鉗應(yīng)盡量下壓深取達(dá)粘膜全層。取出活檢鉗并打開活檢器時要輕,防止粘膜撕裂。立即將活檢組織輕輕在粘在濾紙上,并盡量使粘膜面與濾紙平行。
(2)組織固定:根據(jù)所查抗原的種類采取相應(yīng)的固定方法。我們的體會是:對某些蛋白類抗原,如免疫球蛋白、SC、CEA等一般用95%冷酒精固定較好。95%乙醇不但能固定蛋白抗原,而且保持與抗體的免疫反應(yīng)能力,同樣可以進(jìn)行HE染色。除組織有部分收縮外,組織成分和抗原位置沒有大的改變,組織塊可以在冰箱內(nèi)長期保存。我們對保存26個月的冷酒精固定組織進(jìn)行CEA和SC的研究,效果仍很好。對多肽類激素的研究可以用4%多聚甲醛緩沖淮,Bouin 緩沖液或福爾馬林緩沖液進(jìn)行固定,或直接液氮固定后冷凍切片。冷酒精固定的組織不宜進(jìn)行多肽類激素的研究。對陳舊性福爾馬林的固定的組織可以在抗原表面形成蛋白衣,直接影響抗原抗體反應(yīng)。有人用胰酶消化后暴露抗原部位,進(jìn)行胃泌素細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色,也獲得較好結(jié)果。要進(jìn)行胃腸道多肽類神經(jīng)的免疫組化研究,可用含Triton的固定液和冰凍切片。對小白鼠等動物可向血管內(nèi)注射多聚甲醛等固定劑,然后處死取材。進(jìn)行細(xì)胞膜抗原的單克隆抗體研究時最好用Cryostat冰凍切片,然后丙酮或乙醇固定10min左右。
(3)組織加工:溫度對抗原抗體均有影響。一般在4℃進(jìn)行脫水和透明。包埋選用低熔點(diǎn)蠟(52℃~56℃),浸蠟時間以20min左右為宜(因組織塊較小)。脫蠟和脫二甲苯也應(yīng)在低溫下進(jìn)行。
(4)組織保存及切片:石蠟包埋或其它方法加工后最好立即進(jìn)行切片和免疫細(xì)胞化學(xué)染色。根據(jù)不同的抗原也可以在低溫下保存一段時間后再染色。組織切片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)際上使切面的抗原暴露后直接與抗體相結(jié)合,一般組織切片厚度以5~7μm為宜。如果觀察神經(jīng)纖維則以10~20μm為好。太厚則透射光不易通過,影響觀察,易出現(xiàn)自發(fā)熒光。如果進(jìn)行免疫電鏡觀察,最好超薄切片。
2.涂片或印片標(biāo)本拉網(wǎng)和內(nèi)窺鏡下獲得的胃腸道分泌物等可直接涂片,空氣干燥,再用乙醇固定后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。涂片和印片缺乏明確的組織結(jié)構(gòu),標(biāo)本中常;煊胁煌螒B(tài)的組織細(xì)胞和其它蛋白等無定形成份,很容易造成假陽性,觀察時應(yīng)當(dāng)特別注意。
3.組織分離細(xì)胞將手術(shù)或活檢組織塊用機(jī)械研磨或膠原酶消化等方面可分離出細(xì)胞,加入培養(yǎng)基,在試管內(nèi)進(jìn)行活細(xì)胞免疫熒光或免疫酶等免疫細(xì)胞化學(xué)染色。流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量和定性分析。此法對細(xì)胞膜抗原的研究有較大價值。我們在試管內(nèi)用免疫熒光技術(shù)對周圍血分離的單核樣細(xì)胞進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群和B淋巴細(xì)胞的研究中,發(fā)現(xiàn)OKT3、OKT4、OKT8和Ia的熒光均分布于細(xì)胞膜,隨著細(xì)胞的滾動,猶如火球,非常清晰。
示蹤抗原的抗體必須具有高度特異性,盡量減少非特異性染色和干擾。因此染色前必須測定抗體的工作效價,并用嚴(yán)格的陽性對照。組織切片應(yīng)當(dāng)有連續(xù)切片的HE染色作對照。
應(yīng)當(dāng)根據(jù)設(shè)備條件,具備的抗體和示蹤抗原的特點(diǎn)進(jìn)行選擇。我們的經(jīng)驗(yàn)是:因胞漿性抗原含量較多,可以用簡便和廉價的間接法甚至直接法免疫細(xì)胞化學(xué)染色;對膜抗原及其它一些微量抗原應(yīng)當(dāng)選用PAP或ABC法,如果同時進(jìn)行兩種以上抗原的檢查,最好進(jìn)行雙標(biāo)記和多標(biāo)記免疫細(xì)胞化學(xué)染色;為了顯示較弱的抗原,可以用對比染色技術(shù),背景為另一種顏色,使陽性抗原著色更突出。
1.如研究胃粘膜中抗體產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)當(dāng)掌握在HE染色時的車輪狀核位于胞漿一側(cè),胞漿特別豐富,染色時僅胞漿著色而核不著色等特點(diǎn)。同時應(yīng)了解所研究的抗原在組織中的大致定位及分布規(guī)律。如分泌5-羥色胺的內(nèi)分泌細(xì)胞多位于固有層間質(zhì)內(nèi),VIP和SP分布在固有層神經(jīng)末梢及粘膜下層的神經(jīng)元,胃泌素細(xì)胞分布胃腸腺體細(xì)胞之間。CEA多分布在腺癌細(xì)胞,如果在固有層內(nèi)出現(xiàn)陽性細(xì)胞,要謹(jǐn)慎對待,必須排除污染、內(nèi)源酶或自發(fā)熒光,同時與連續(xù)切片的HE染色切片對比觀察才能作出判斷。
2.陽性結(jié)果的定量分析免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色受到的影響因素較多,最好在相同組織加工方面、統(tǒng)一批號抗血清和標(biāo)記抗體、統(tǒng)一染色技術(shù)和結(jié)果判定方法,同時對病態(tài)和正常組織進(jìn)行對照觀察才能增加可比性。用免疫組織化學(xué)進(jìn)行抗原定量分析時,可根據(jù)著色程度,選用某一基點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量計數(shù),但容易受主觀因素的影響。近年來,數(shù)字減影技術(shù)的應(yīng)用,大大提高了定量研究的準(zhǔn)確性。對陽性細(xì)胞的計數(shù),多采取以下幾種方法:
(1)直接計數(shù)法:以10~20個隨意選擇的高倍視野直接進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),或計算100~200個總細(xì)胞中陽性細(xì)胞的數(shù)量。由于陽性細(xì)胞分布的不均勻性,可能存在一定誤差。
(2)體積計數(shù)法:測定單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù),再算出每立方毫米體積內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)。一般組織切片只有5~7μm厚,與1mm厚度組織切片的細(xì)胞密度不可能完全一致。
(3)細(xì)胞密度計數(shù)法:即計算單位粘膜面積的陽性細(xì)胞數(shù)。有人提出以0.5mm寬,粘膜切面會層(約0.6mm)作為一個單位。因內(nèi)窺鏡取材時,組織塊不規(guī)則,顯微鏡下要具體選擇有一定困難,。我們用改良的Dellesses公式進(jìn)行計算比較方便。原公式NV=N(P∑r2)×109,NV代表每立方毫米體積細(xì)胞數(shù);N代表細(xì)胞總數(shù),r為測微器小方格邊長(μm);∑為f1411.cn/hushi/切片厚度(μm);P為小方格數(shù)。我們只計算每平方毫米面積細(xì)胞數(shù),即D=N/(P∑r2)(r單位為mm)。方和邊長為0.5mm的測微器放在目鏡下,物鏡放大4倍,即用測微器去量放大4倍的物體,測出的邊長必須縮小4倍才是物體的真正面積,已知r為0.5mm,將上述數(shù)據(jù)代入公式,得D=N(r/4)2=16N/(Pr2)=16N/(P(0.5)2)=64N/P。只要計算整個組織切片的細(xì)胞數(shù)和所占小方格數(shù),即可得出陽性細(xì)胞密度(細(xì)胞數(shù)/mm2)。組織分離細(xì)胞可通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行計數(shù)。