實用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié)　有關(guān)細(xì)胞和組織學(xué)技術(shù)

一、細(xì)胞和組織

免疫組織化學(xué)技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗體檢測細(xì)胞和組織內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷和研究疾病的目的�？乖�的準(zhǔn)確顯示和定位與制備的細(xì)胞和組織標(biāo)本質(zhì)量的好壞有著密切的聯(lián)系。由于各種抗原的生化、物理性質(zhì)不同，如溫度高低、酸堿度強(qiáng)弱及各種化學(xué)試劑的作用均可影響抗原的免疫學(xué)活性，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確定位。因此，細(xì)胞和組織標(biāo)本的采集制備在免疫組織化學(xué)技術(shù)中占有十分重要的位置。

（一)細(xì)胞標(biāo)本的取材

目前，免疫組化技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)診斷，如鑒別低分化癌與惡性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA應(yīng)用于胸腹水中間皮瘤與癌的鑒別。McAb應(yīng)用于淋巴白血病和惡性淋巴瘤的分類分型。近年來，培養(yǎng)細(xì)胞的免疫組化技術(shù)在鑒定細(xì)胞的種類、分化程度、表面抗原特點以及腫瘤結(jié)構(gòu)成分改變等方面的研究均起到了積極作用。

細(xì)胞標(biāo)本的取材有以下3種方法:

1．印片法主要應(yīng)用于活組織檢查標(biāo)本和手術(shù)切除標(biāo)本。新鮮標(biāo)本以最大面積剖開，充分暴露病變區(qū)，將載玻片輕輕壓于病變區(qū)，脫落的細(xì)胞便粘附在玻片上，立即浸入細(xì)胞f1411.cn/wszg/固定液內(nèi)5-10min，取出后自然干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)點是簡便省時，細(xì)胞抗原保存較好。缺點是細(xì)胞分布不均勻，玻片上細(xì)胞重疊，影響標(biāo)記效果。

2．穿刺吸取涂片法主要應(yīng)用于實質(zhì)器官的病變區(qū)，如肝、腎、肺、淋巴結(jié)、軟組織等。用細(xì)針穿刺吸取病變區(qū)內(nèi)液體成分，如穿刺液較少，可直接涂抹在載玻片上，力求細(xì)胞分布均勻。如穿刺液較多，細(xì)胞豐富，可用洗滌法：將穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（RPMi 1640液)的試管內(nèi)，輕輕攪拌，以500rpm低速離心5-10min后，棄上清液，將沉淀制成細(xì)胞懸液（濃度約2×106細(xì)胞/ml)，吸取1滴于載玻片上，輕輕涂抹，待涂片略干即可固定。

該法穿刺吸取直接涂片的優(yōu)點是操作簡便，細(xì)胞形態(tài)保持較好。缺點是細(xì)胞分布不均勻。洗涂法片雖可彌補這一缺點，但操作復(fù)雜，細(xì)胞常常發(fā)生變形。

3．體液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、腦脊液等體液多、細(xì)胞少的標(biāo)本。體液采取后，必須及時處理，更不宜加固定液。根據(jù)標(biāo)本內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少選用不同的處理方法：①細(xì)胞數(shù)量極多者，可吸取少量液體直接涂在玻片上。②細(xì)胞數(shù)量較少者，可將液體自然沉淀，然后吸取5ml左右沉淀液，以1500rpm離心10min，棄上清液，將沉淀涂片，略干后固定備用。

如用細(xì)胞離心涂片器(Cytospin )，可將標(biāo)本用上述離心沉淀法制成2×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，吸取50μl加入涂片器內(nèi)，離心后即制成分布均勻的細(xì)胞涂片，細(xì)胞分布在直徑約6mm的小圓圈內(nèi)，每個圓圈內(nèi)的細(xì)胞數(shù)約105個(Danos,1976)。

培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的取材可根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞特性分別采取不同的方法。某些細(xì)胞有貼壁生長的特性，如纖維母細(xì)胞、粘液癌細(xì)胞等，只需將載玻片或蓋玻片插入培養(yǎng)液內(nèi)即可收集到理想的細(xì)胞標(biāo)本。某些細(xì)胞只能在培養(yǎng)液中生長，可用上述體液沉淀離心涂片法處理。

制備細(xì)胞涂片應(yīng)注意：①標(biāo)本反復(fù)離心洗滌，細(xì)胞的粘附性降低，在免疫組化染色過程中容易脫片，因此，在制備涂片前載玻片上應(yīng)涂粘附劑。②為節(jié)　省試劑和便于鏡下觀察和記數(shù)，應(yīng)將細(xì)胞集中到直徑0.6-1.0cm的圓圈內(nèi)，細(xì)胞總數(shù)以105個為宜。③粘液豐富的標(biāo)本，如痰液，胃液等，未經(jīng)特殊處理，一般不宜作免疫組化標(biāo)記。

（二)組織標(biāo)本的取材

組織標(biāo)本主要取之于活組織檢查標(biāo)本、手術(shù)切除標(biāo)本、動物模型標(biāo)本以及尸體解剖標(biāo)本等。前三者均為新鮮組織，后者是機(jī)體死亡2h以上的組織，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有變性消失，嚴(yán)重彌散現(xiàn)象，因此，尸檢組織應(yīng)盡快固定處理，以免影響免疫組化標(biāo)記效果。但有些較穩(wěn)定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸檢標(biāo)本中，抗原顯示仍較好。

組織標(biāo)本的取材常常受到各種因素的影響，如各種內(nèi)窺鏡鉗取的組織，常因過度擠壓而變形，嚴(yán)重者組織結(jié)構(gòu)被破壞。大組織標(biāo)本病變分布廣泛，抗原在組織中分布不均一，常出現(xiàn)人為的組織取材不準(zhǔn)確。為了避免上述缺點，組織取材時應(yīng)注意：①活檢鉗的刃口必須鋒利，以免組織受擠壓；②取材部位必須是主要病變區(qū)；③必須取病灶與正常組織交界區(qū)；④必要時取遠(yuǎn)距病灶區(qū)的正常組織作對照。

為充分保存組織的抗原性，標(biāo)本離體后慶立即作處理，或立即速凍成凍塊進(jìn)行冰凍切片，或立即用固定液固定進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、石蠟切片。如不能迅速制片，可貯存于液氮罐內(nèi)或-70。C冰箱內(nèi)備用。

二、細(xì)胞和組織的固定

（一)固定

為了更好的保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，有必要對細(xì)胞和組織進(jìn)行固定。固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，更重要的是最大限度的保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬�溶性抗原，防止抗原彌散�?/p>

不同抗原，其穩(wěn)定性也不相同，因而對固定劑的耐受性差異較大。如T淋巴細(xì)胞表面抗原屬不穩(wěn)定性抗原，對固定劑的耐受較差，抗原活性容易喪失。而HBsAg屬穩(wěn)定性抗原，其抗原活性很少受固定劑種類、固定時間、溫度等因素的影響。

（二)固定劑

用于免疫組織化學(xué)的固定劑種類較多，性能各異，在固定半穩(wěn)定性抗原時，尤其重視固定劑的選擇，介紹如下。

1．醛類固定劑雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點是對組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。有人認(rèn)為它對IgM、IgA、J鏈、K鏈和λ鏈的標(biāo)記效果良好，背景清晰，是常用的固定劑。

（1)10%鈣-福爾馬林液（濃甲醛10ml，飽和碳酸鈣90ml)。

（2)10%中性緩沖福爾馬林液（濃甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml)。

（3)4%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，兩者混

合加熱至60℃，攪拌并滴加1nNaOH至清晰為止，冷卻后加PBS液至總量1000ml)。

（4)戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，濃甲醛10ml，蒸餾水加至100ml)。

戊二醛是二醛基化合物，交聯(lián)結(jié)合力比甲醛大，Bullock認(rèn)為交聯(lián)過強(qiáng)，可出現(xiàn)組織改變和空間遮蔽現(xiàn)象，影響組織的抗原性。但McDonald等認(rèn)為，該試劑用于PAP法免疫酶標(biāo)記效果仍滿意。

（5)甲醛升汞固定液（即B5固定液。濃甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸鈉1.25g,蒸餾水90ml)。

有人認(rèn)為此固定液懸液是較理想的固定液，標(biāo)記IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人認(rèn)為它減弱細(xì)胞的抗原性，上皮細(xì)胞可產(chǎn)生非特異性熒光，故不宜用于免疫熒光標(biāo)記。氯化汞是一種強(qiáng)蛋白凝固劑，但對組織穿透性弱，且使組織收縮，故與甲醛混合使用。

（6)醋酸-甲醛液（濃甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理鹽水加至100ml)。

Bullock等認(rèn)為此液固定效果良好，組織可不經(jīng)消化，胞漿IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J鏈標(biāo)記均呈陽性，且背景染色極淡。如標(biāo)記IgG用PAP法第一抗體僅為甲醛升汞液的1/10。此液內(nèi)醋酸既可防止組織收縮，又可暴露胞漿免疫球蛋白抗原決定簇。

（7)Bouin’s液。

該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑之一，對組織穿透力較強(qiáng)而收縮性較小，比單獨醛類固定更適合免疫組化染色。Kayhko認(rèn)為用于標(biāo)記B細(xì)胞的J鏈較好，但Bullock則認(rèn)為它可導(dǎo)致Igg γ重鏈變性，故必需加大第一抗體的濃度。

（8)Zamboni’s液。

該固定液可用于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對超微結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于純甲醛，也適用于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對組織穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。固定時間6-18h。

（9)PLP液（過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液)。

該固定劑適用于富含糖類的組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是過碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過賴氨酸的雙價氧基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。組織抗原大多數(shù)是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定液有選擇性地使糖類固定，既穩(wěn)定缺的，又不影響其在組織中的位置（固定劑7-9配制法見附錄1)。

2．非醛類固定劑Pe等人比較幾種非醛類雙功能試劑指出，碳化二亞胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亞胺、和對苯醌等均適用于多肽類激素的組織固定，單獨使用時，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明顯改善。

（1)碳化二亞胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI)液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于標(biāo)記多肽類激素的組織，對標(biāo)記IgA、IgG效果不佳。

（2)碳二亞胺-戊二醛液（ECD-G液)：配制法見附錄一。

ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimideHydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽，簡稱乙基-CDI。

該液常用于多肽類激素的固定，對酶等蛋白質(zhì)固定效果良好，對細(xì)胞內(nèi)抗原定位，超微結(jié)構(gòu)保存好，是一種培養(yǎng)細(xì)胞電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究的良好固定劑。

（3)Zenker’s 液（重鉻酸鉀2.5g,氯化汞5g,硫酸鈉1g,蒸餾水100ml,混合溶解后，臨用時加水醋酸5ml)。

該固定液對免疫球蛋白染色最佳，固定時間約2-4h，染色前必須脫汞色素。

3．丙酮及醇類固定劑系最初免疫細(xì)胞化學(xué)染色的固定劑，其作用是沉淀蛋白質(zhì)和糖，對組織穿透性很強(qiáng)，保存抗原的免疫活性較好。但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，解決的辦法是和其它試劑混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。

（1)Clarke氏改良劑（100%酒精95ml，冰醋酸5ml)，用于冰凍切片的后固定。

（2)乙醚（或氯仿)與乙醇等量混合液。

Danos（1976)等認(rèn)為其組織穿透性極強(qiáng)，即使涂片上富于過多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的細(xì)胞固定液。

（3)AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml。

（4)Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存?zhèn)溆谩?/p>

（5)Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存?zhèn)溆谩?/p>

以上兩種固定液適宜某些抗原，癌基因蛋白產(chǎn)物檢測的 固定，P53抗癌基因蛋白產(chǎn)物，PC-NA等抗原的保存。

丙酮的組織穿透性和脫水性更強(qiáng)，常用于冰凍切片及細(xì)胞涂片的后固定，保存抗原性較好，平時4。C低溫保存?zhèn)溆�，臨用時，只需將涂片或冰凍切片插入冷丙酮內(nèi)5-10min，取出后自然干燥，貯存于低溫冰箱備用。

以上介紹了免疫組織化學(xué)中常用的固定液，用于免疫組化的固定劑種類很多（見附錄)，不同的抗原和標(biāo)本需經(jīng)過反復(fù)試驗，選用最佳固定液。不少學(xué)者認(rèn)為，迄今尚無一種標(biāo)準(zhǔn)固定液可以用于各種不同的抗原固定。而且同一固定液固定的組織，免疫組化染色標(biāo)記結(jié)果可截然不同，致使人們無所適從。選擇最佳固定液標(biāo)準(zhǔn)是：①最好地保持細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化技術(shù)中是禁用的。實際經(jīng)驗告訴我們，中性緩沖福爾馬林（或多聚甲醛)是適應(yīng)性較廣泛的固定液，但固定時間不宜過長。必要時，可作多種固定液對比，從而選出理想的標(biāo)準(zhǔn)固定液。

固定組織時應(yīng)注意：①應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過大過厚，必須小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否則組織中心固定不良影響效果。④組織固定后應(yīng)充分水洗，去除固定液造成的人為假象。

（三)固定方法

1．浸入法（Immersionmethod)將組織浸泡在固定液內(nèi)，必要時可在低溫（4。C)環(huán)境下進(jìn)行，固定時間可根據(jù)抗原的穩(wěn)定性以及固定液性質(zhì)而定，一般在2-12h之間。

2．灌注法（Irrigationmethod)此法適用于動物實驗研究。自左心室插入主動脈，先以krebs或生理鹽水沖冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注動物于4。C冰箱內(nèi)，次日取出腦組織或其它組織。外周組織一般在灌注后30min內(nèi)取材，取組織置同一固定劑中浸入1-3h，然后修整組織塊。有主張用冷固定劑（4。C)進(jìn)行灌注。我們的體會是一般光鏡下觀察的標(biāo)本，室溫固定即可獲滿意效果。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，保持組織新鮮是很重要的，據(jù)報告，肽類抗原活性在斷絕血液供應(yīng)后24h幾乎完全喪失。

灌注法固定可使固定液迅速達(dá)到全身各組織。達(dá)到充分固定之目的。灌注沖洗還能排除紅細(xì)胞內(nèi)假過氧化物酶的干擾。浸入法主要用于活檢和手術(shù)標(biāo)本，以及其它不能進(jìn)行灌注的組織固定。

三、組織切片技術(shù)

應(yīng)用于光鏡的免疫組織化學(xué)染色的切片厚度一般要求5μm左右，神經(jīng)組織的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。

1．冰凍切片 是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。

冰凍時，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率（形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認(rèn)為冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C,f1411.cn/hushi/從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)1018，然后再減慢�；�于上述理論可采取以下措施減少冰晶的形成。

（1)速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時間，減少冰晶的形成。其方法有二：

①干冰-丙酮（酒精)法：將150-200ml丙酮（酒精)裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可達(dá)-70℃C，用一小燒杯（50-100ml)內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精)飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70℃時即可使用。將組織（大小為1cm×0.8cm×0.5cm)投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存。

②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時即開始?xì)饣�沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆�，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。

（2)將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。

影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機(jī)有兩類：

①恒慢冰凍切片機(jī)（Cryastat)：為較理想的冰凍切片機(jī)，型號很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于-30℃C低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完全能滿足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

②開放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度大，在高溫季節(jié)　，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點是價廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。

冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存。

2．石蠟切片 　其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應(yīng)在4℃。C下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋)。

組織塊脫水、透明、浸蠟時間參考表1-3：

表 1-3 組織塊處理時間表

以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機(jī)代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右。

石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強(qiáng)度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

石蠟切片優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freeze drying embedding methed)，可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機(jī)（Freezing dryer)在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標(biāo)記、免疫酶標(biāo)記及放射自顯影。

3．振動切片　 用振動切片機(jī)（Vibratotme)，可以把新鮮組織（不固定不冰凍)切成厚片20～100μm，以漂浮法在反應(yīng)板進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應(yīng)陽性部位，修整組織進(jìn)行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀察等。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能較好地保留組織內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細(xì)胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統(tǒng)抗原分布研究。這種包埋前染色，尤其實用于免疫電鏡觀察。

4．塑料切片　 塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類（Glycolmethacrylate, GMA)及環(huán)氧樹脂類（Epon 812,618)，其優(yōu)點是可以同時作光鏡和電鏡檢測，能相互對照所查抗原，定位準(zhǔn)確。塑料包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片（Semithinsection)。GMA保存抗原較好，不與組織產(chǎn)生共聚合，但形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)欠佳。環(huán)氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結(jié)構(gòu)。塑料包埋切片由于處理程序繁多，抗原活性易丟失。同時半薄切片進(jìn)行免疫染色時，抗血清不易穿透樹脂，因此，塑料切片主要用于免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標(biāo)本，切片薄切片后不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)部位呈黑點狀，定位后進(jìn)一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。

5．超薄切片　 電鏡標(biāo)本制作見第七章　，應(yīng)用超薄切片機(jī)（Ultrotome)進(jìn)行切片。

6．碳蠟切片　 碳蠟（Carbowax)，學(xué)名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG)為水溶性蠟。根據(jù)其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點分別38℃C和52。C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。

本法的特點是組織固定水洗后，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規(guī)石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面后自然展開，碳虹迅速深化，組織片即可展平，制片過程簡單易行。

具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內(nèi)。①組織固定后充分水洗去除固定液，用濾紙吸干組織表面水。②將組織浸入碳蠟（1500)內(nèi)，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液（1500和4000等量混合液)，52℃30min。④浸入等量混合碳蠟液（或根據(jù)氣溫、濕度變化調(diào)整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合)。⑤用等量混合碳蠟或調(diào)整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中，碳蠟組織塊應(yīng)盡量避免與水或冰接觸，貯存時應(yīng)密封干燥冷藏。

本法優(yōu)點是操作程序減少，時間縮短，組織不經(jīng)有機(jī)溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好，組織結(jié)構(gòu)清晰。缺點是夏季室溫高時切片較困難，連續(xù)切片不如石蠟切片順利；由于碳蠟有強(qiáng)吸濕性，不易長期保存。

7．玻片處理和涂膠 在免疫組化染色過程中由于各種原因常造成標(biāo)本（細(xì)胞制片和組織切片)脫片現(xiàn)象，影響了工作質(zhì)量和速度。一般采取兩種方法即可防止脫片現(xiàn)象出現(xiàn)。

（1)載玻片和蓋玻片處理：新載玻片上有油污，必須經(jīng)過清潔液浸泡12～24h，流水充分漂洗后用蒸餾水清洗5遍以上，浸泡在95%酒精內(nèi)2h，用綢布擦干或用紅外線烤箱烤干均可，貯放于玻片盒內(nèi)備用。蓋玻片很薄，以上處理程序必須縮短，清潔液浸泡只需2h，流水沖洗注意勿損傷玻片等。

（2)載玻片上涂粘附劑：粘附劑種類較多，常用的有以上幾種：①樹脂膠（Resin glue)又稱白色乳膠，為木工用，有進(jìn)口，國產(chǎn)之分，有人認(rèn)為進(jìn)口白色樹脂膠較穩(wěn)定，我們認(rèn)為國產(chǎn)白乳膠（聚醋酸乙烯乳液J-北京產(chǎn))質(zhì)量尚穩(wěn)定。使用濃度為1%～2%，以蒸餾水稀釋即可。②甘油明膠，混勻后涂在載玻片上，切片貼附后置有副醛的干燥器內(nèi)，加熱80℃1h。③甲醛明膠， 混合后即可涂片。④鉻明礬明膠， 混合后即可涂片，置37℃溫箱烤干。⑤多聚賴氨酸液：多聚賴氨酸0.1g，加蒸餾水10ml，混合后即可涂片。此液不宜多配制。⑥3-Amino propy Eri-ethoxy Silame（APES)。

粘附劑2～5配制法見附錄一。