一、動(dòng)物的選擇
選擇合適的動(dòng)物進(jìn)行免疫極為重要。選擇時(shí)應(yīng)考慮以直幾個(gè)因素:①抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠(yuǎn)越好;親緣關(guān)系太近不易產(chǎn)生抗體應(yīng)答(如兔-大鼠之間,雞-鴨之間)。②抗血清量的需要:大動(dòng)物如馬、騾等可獲得大量血清(一頭成年馬反復(fù)采血可獲得10000ml以上的抗血清);但有時(shí)抗體需要是不多,選用家兔或豚鼠即可。③抗血清的要求:抗血清可分為R型和H型。H型抗血清用于沉淀反應(yīng)較難掌握,因而極少應(yīng)用。④抗原的選擇:對(duì)蛋白質(zhì)抗原,大部分動(dòng)物皆適合常用的是山羊和家兔。但是,在某些動(dòng)物體內(nèi)有類(lèi)似的物質(zhì)或其它原因,對(duì)這些動(dòng)物免疫原性極差,如IgE對(duì)綿羊、胰島素對(duì)家兔、多種酶類(lèi)(如胃蛋白酶原等)對(duì)山羊等,免疫時(shí)皆不易出現(xiàn)抗體。這些物質(zhì)有時(shí)可以用豚鼠(如胰島素等)、火雞、甚至豬、狗、貓等作試驗(yàn)免疫。⑤甾體激素免疫多用家兔;酶類(lèi)免疫多用豚鼠。
二、免疫劑量、時(shí)間和途徑
免疫原合適劑量的選定應(yīng)考慮抗原性強(qiáng)弱、分子量大小和免疫時(shí)間。抗原需可量多,時(shí)間間隔長(zhǎng),劑量可適當(dāng)加大。大動(dòng)物抗原劑量(以蛋白抗原為準(zhǔn))約0.5~1mg/只,小動(dòng)物約0.1~0.6mg/只。有時(shí)主觀希望加強(qiáng)免疫效果而不適當(dāng)?shù)丶哟髣┝,往往?huì)弄巧成拙。因?yàn)閯┝考哟髽O易造成免疫耐受(免疫抑制)而遭失敗。已有證明,幾微克的蛋白質(zhì)也能很好地免疫出抗血清。
免疫注射的途徑也很重要。一般采用多點(diǎn)注射,一只動(dòng)物注射總數(shù)約為8~10點(diǎn),包括足掌及肘窩淋巴結(jié)周?chē)巢績(jī)蓚?cè)、頜下、耳后等處皮內(nèi)或皮下,皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng),對(duì)提高抗體效價(jià)有利。但皮內(nèi)注射較困難,特別是天冷時(shí)更難注入(因佐劑加入后粘度較大)。其他途徑還有肌內(nèi)、腹腔、靜脈、腦內(nèi)等,但較少應(yīng)用。如抗原極為寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法,抗原只需10~100μg;方法是先用不完全佐劑在足作基礎(chǔ)免疫(預(yù)免疫),10~15天后可見(jiàn)肘窩處有腫大的淋巴結(jié)(有時(shí)在腹股溝處觸及),用兩手指固定好淋巴結(jié),消毒后用微量注射器直接注射入抗原(一般不需要佐劑)。
免疫間隔時(shí)間也是重要因素,特別是首次與第二次之間更應(yīng)注意。第一次免疫后,因動(dòng)物機(jī)體正處于識(shí)別抗原和B細(xì)胞增殖階段,如很快接著第二次注入抗原,極易造成免疫抑制。一般以間隔10~20天為好。二次以后每次的間隔一般為7~10天,不能太長(zhǎng),以防刺激變?nèi),抗體效價(jià)不高。對(duì)于半抗原的免疫間隔則要求較長(zhǎng),有的報(bào)告1個(gè)月,有的長(zhǎng)達(dá)40~50天,這是因?yàn)榘肟乖切》肿,難以刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)之故。免疫的總次數(shù)多,多為5~8次。如為蛋白質(zhì)抗原,第八次免疫未獲得抗體,可在30~50天后再追加免疫一次;如仍不產(chǎn)生抗體,則應(yīng)更換動(dòng)物。半抗原需經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的免疫才能產(chǎn)生高效價(jià)抗體,有時(shí)總時(shí)間為一年以上。
三、動(dòng)物采血法
動(dòng)物免疫3~5天后,如抗血清鑒定合格(見(jiàn)下節(jié)),應(yīng)在末次免疫后5~7天及時(shí)采血,否則抗體將會(huì)下降。因故未及時(shí)取血,則應(yīng)補(bǔ)充免疫一次(肌肉、腹腔或靜脈內(nèi)注射,不加佐劑),過(guò)5~7天取血。
1.頸動(dòng)脈放血法這是最常用的方法,對(duì)家兔、山羊等動(dòng)物皆可采用。在動(dòng)物頸外側(cè)做皮膚切口,拉開(kāi)皮膚后可見(jiàn)斜行的胸鎖乳突肌,將此肌鈍性分離并推向后方,即可見(jiàn)到淡紅色有彈性的總動(dòng)脈。將此動(dòng)f1411.cn/hushi/脈輕輕游離(連同與之同行的迷走神經(jīng)),用絲線(xiàn)將遠(yuǎn)心端結(jié)扎,近心端用止血鉗夾住,另一止血鉗夾住動(dòng)脈迷走神經(jīng),用以固定。沿結(jié)扎處剪斷血管,用固定止血鉗將斷端放入瓶口,慢慢打開(kāi)夾持的止血鉗,動(dòng)脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快,動(dòng)物死亡也快,取血量略少于其他放血法。如在放血大約總量的一半時(shí),暫時(shí)將動(dòng)脈夾住片刻,再繼續(xù)放血,得血量可以多些。
另外一種慢放血法是在動(dòng)脈內(nèi)插入一采血器,用閉式放血。在頸動(dòng)脈內(nèi)插入一較粗的玻璃管,將血管與玻璃管用線(xiàn)扎牢,玻璃管接一橡皮管引血入瓶,也極為方便。
2.心臟采血法此法多用于豚鼠、大鼠、雞等小動(dòng)物。采血技術(shù)應(yīng)熟練,穿刺不準(zhǔn)容易導(dǎo)致動(dòng)物急性死亡。
3.靜脈多次采血法家兔可用耳中央靜脈,山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次,有時(shí)可采集多量血液。如用耳靜脈切開(kāi)法,一只家兔可采百余毫升血液(用頸動(dòng)脈放血最多可獲70~80ml,一般只有50ml左右)。用頸靜脈采集綿羊血,一次可放300ml,放血后立即回輸10%葡萄糖鹽水,三天后仍可采血200~300ml。動(dòng)物休息一周,再加強(qiáng)免疫一次,又可采血二次。如此,一只羊可獲1500~2000ml血液。小鼠取血往往采取斷尾或摘除眼球法,每鼠得血一般不超過(guò)2ml。
抗血清的分離多采f1411.cn/job/用室溫自然凝固,然后放置37℃或4℃待凝塊收縮。前者迅速,但得血清較少;后者時(shí)間長(zhǎng),有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)溶血,但獲得血清多,而且效價(jià)不會(huì)下跌。
抗血清分出后是否要經(jīng)56℃30min滅活有兩種不同意見(jiàn)。一種認(rèn)為血清中有許多活性酶,特別是球蛋白的降解酶,如不清除,血清存放過(guò)程中將導(dǎo)致抗體效價(jià)下降。另外的意見(jiàn)認(rèn)為,這種自然降解是微不足道的,56加溫后,有些球蛋白會(huì)發(fā)生熱變性或者熱聚合。含這種聚合大分子蛋白的抗血清用于免疫濁度試驗(yàn)時(shí),可因沉淀劑(如PEG)的加入而發(fā)生假性混濁。