免疫學和免疫學檢驗:第三節(jié)　化學發(fā)光免疫測定

化學發(fā)光反應參與的免疫測定分為二種類型。第一種是以發(fā)光劑作為酶免疫測定的底物，通過發(fā)光反應增強測定的敏感性；第二種是以發(fā)光劑作為抗體或抗原的標記物，直接通過發(fā)光反應檢測標本中抗原或抗體的含量。

一、化學發(fā)光酶免疫測定

從標記免疫測定來看，化學發(fā)光酶免疫測定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA)應屬酶免疫測定。測定中2次抗原抗體反應步驟均與酶免疫測定相同，僅最后一步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過化學發(fā)光反應發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。兩種常用的標記酶，辣根過氧化物酶（HRP)和堿性磷酸酶（AP)均有其發(fā)光底物，由此建立的CLEIA均在臨床檢驗中應用。

（一)HRP標記的CLEIA

常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H₂O₂在無HRP催化時也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強度測定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。

HRP催化魯米諾氧化的反應可被某些酚試劑（如鄰－碘酚)或螢火蟲熒光素酶等加強。加強劑的作用是增強發(fā)光和延長發(fā)光時間，由此可提高敏感度。

（二)AP標記的CLEIA

在以AP為標記酶的CLEIA中，應用的底物為adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如PPD可供應用。發(fā)光反應的反應式如下：

二、化學發(fā)光標記免疫測定

化學發(fā)光f1411.cn/rencai/標記免疫測定亦稱化學發(fā)光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA)，是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的一類免疫測定方法。用作標記的化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件：①能參與化學發(fā)光反應；②與抗原或抗體偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應和反應動力；④應不改變或極少改變被標記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾類和吖啶酯類發(fā)光劑等均是常用的標記發(fā)光劑。

魯米諾類的發(fā)光反應須有催化劑（例如過氧化物酶)催化，且與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合后其發(fā)光作用減弱，因此魯米諾類在CLEIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標記。吖啶酯類對CLIA更為適用，其顯著的優(yōu)點是：①氧化反應不需催化劑，只要堿性環(huán)境中就可以進行。反應物在加入H₂O₂后再加氫化鈉溶液，發(fā)光反應迅速，本底低。②在氧化反應過程中，結(jié)合物被分解，因此游離的吖啶酯的發(fā)光不受抑制。試劑穩(wěn)f1411.cn定性好。

三、電化學發(fā)光免疫測定

在電化學發(fā)光免疫測定（electrochemluminescenceimmunoassay，ECLI)中應用的標記物為電化學發(fā)光反應的底物三聯(lián)吡啶釕，其衍生物N-羥基琥珀酰胺（NHS)酯可通過化學反應與抗體或不同化學結(jié)構的抗原分子結(jié)合，制成標記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分二個步驟進行。以雙抗體夾心法測定抗原為例，第一步在試管中進行，反應物為Ru(bpy)₃²⁺標記的抗體、吸附在磁性微球上的固相抗體以及受檢的標本，反應式如圖18-2。

圖18-2 ECLI中的抗原抗體反應

反應后除由標記抗體、固相抗體與標本中的抗原形成的夾心復合物外，尚有多余的標記抗體和固相抗體。第二步是將反應液輸入特殊的檢測儀器的反應室中（圖18-3)，隨即用含三丙胺（TPA)的緩沖液沖洗。反應室電極下有磁鐵。含磁性微球的夾心復合物及游離的固相抗體被吸附在電極表面，游離的標記抗體隨沖洗液流出。此時在反應室中即發(fā)生如圖18-1的電化學發(fā)光反應。發(fā)出的光由光電倍增管轉(zhuǎn)為信號，通過電信號的測定反映標本中抗原的含量。

圖18-3 ECLI中的ECL反應

ECLI具有以下優(yōu)點：①標記物在再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定；②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；③線性范圍寬，＞10⁴；④反應時間短，20min以內(nèi)可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上。

四、在醫(yī)學檢驗中的應用

放射免疫分析因標記物的放射性在應用中存在不少問題。為替代這一廣被采用的測定方法，近年來創(chuàng)立了多種新的標記免疫技術�；瘜W發(fā)光免疫測定具有明顯的優(yōu)越性：①敏感度高，甚至超過RIA；②精密度和準確性均可與RIA相比；③試劑穩(wěn)定，無毒害；④測定耗時短；⑤測定項目多；⑥已發(fā)展成自動化測定系統(tǒng)。因此化學發(fā)光免疫測定在醫(yī)學檢驗中不僅能取代RIA，而且可得到更為廣泛的應用。