動(dòng)脈血管壁膠原提取的基本方法是,首先除去凝血等其他雜質(zhì),由于膠原為桿狀三螺旋結(jié)構(gòu),能耐受胃蛋白酶的作用,但是兩端球蛋白結(jié)構(gòu)能被胃蛋白酶水解。膠原纖維內(nèi)分子間的共價(jià)交聯(lián)是由分子末端賴氨酸或羥賴氨酸形成,用胃蛋白酶切斷末端交聯(lián)結(jié)構(gòu),使膠原分子的巨形結(jié)構(gòu)被破壞,從完整分子可提出各種類型的膠原。
(一)膠原的初步分離
1.小心取出動(dòng)脈血管,用0.05mol/L BPS pH7.8洗凈凝血塊,3kr/min離心10min。
2.冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪,蒸餾水洗滌3次。
3.將組織破碎,加三倍體積組織勻漿處理液(0.5mol/L乙酸,pH2.5,1%胃蛋白酶)于4℃48h,16kr/min離心45min,同樣方法重復(fù)3次。
4.向留取的上清液中緩緩加入NaCl,最終達(dá)到4mol/L濃度,攪拌12~24h,15kr/min離心45min,棄上清。
5.進(jìn)一步分離各種膠原可用分段鹽析和柱層析法進(jìn)行操作。
(二)膠原的分段鹽析
1.取初級(jí)提取物加0.1mmol/L乙酸,加NaCl至0.7mmol/L,15kr/min離心20min。沉淀提、、Ⅲ、Ⅳ型膠原,上清提、、Ⅴ型膠原。
2.沉淀,加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保濕16h,10kr/min離心20min,上清液加NaCl至4mol/L,離心,沉淀物為Ⅳ型膠原。
3.1mol/L NaCl溶解沉淀,加3倍體積Tris-HCl pH7.4,10kr/min離心20min,沉淀為Ⅲ型膠原。
4.上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min離心20min,沉淀為Ⅰ膠原。
5.取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min離心20min。
6.沉淀溶于4倍體積1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4,加NaCl至4mol/L 10kr/min離心20min。
7.上清加NaCl至4mol/L,調(diào)pH到3.5,離心得沉淀再加5倍體積0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液懸浮16h,小心取上清加NaCl至4mol/L,10kr/min離心10min,沉淀為Ⅳ型膠原。
8.將6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE懸浮16h,上清加NaCl至4mol/l,10kr/min離心10min,沉淀為Ⅴ型膠原。
(三)將初步提取的膠原加到DEAE纖維柱上,用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脫,230nm波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫物。因?yàn)槟z原在pH7.5時(shí)均帶正電荷,不與DEAE柱結(jié)合,所以被柱結(jié)合的則為非膠原蛋白。
蛋白多糖具有可溶于4mol/L鹽酸胍的性質(zhì),再經(jīng)DEAE-纖維素層析除去其他雜質(zhì),非蛋白多糖與蛋白多糖用不同濃度尿素可分段層析分開(kāi)。
1.取動(dòng)脈血管小心除去血管周圍脂肪組織和纖維膜,用冷0.5mol/l PBS pH7.8洗滌,2kr/min離心10min。
2.用勻漿器破碎,加入15倍體積的提取液(0.05mol/L乙酸pH5.8、4.0mol/L鹽酸胍、0.1mol/l6-氨基乙酸EDTA、3mol/L芐脒),于4℃緩慢振蕩24h,10kr/min離心30min。
3.取上清透析濃縮30倍。
4.將提取液加入已經(jīng)平衡好的DEAE-纖維素柱上,分別用0.15mol/l NaCl和2mol/LNaCl洗脫,均用280nm波長(zhǎng)紫外監(jiān)測(cè)儀連續(xù)監(jiān)測(cè)。
提取方法較多,各有優(yōu)缺點(diǎn)。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L鹽酸胍抽提,再用膠原酶水解其他非彈性蛋白組分,最后還原二硫鍵,分離提取彈性蛋白。具體方法如下:
1.將動(dòng)脈血管壁洗凈,小心除去附著結(jié)締組織。
f1411.cn/sanji/2.將血管壁組織浸于4℃ 50%的吡啶液,破碎組織,3kr/min離心15min。
3.取沉淀用蒸餾水洗滌3次,真空干燥后研成粉末。
4.將粉末懸浮于2mol/L NaCf1411.cn/shiti/l,4℃攪拌24h,3kr/min離心20min,棄上清,沉淀用蒸餾水洗3次。
5.將沉淀用無(wú)水乙醇脫脂20min,用氯仿-甲醇(2:1)處理20min,再用乙醚沖洗干燥,3kr/min離心20min,真空干燥沉渣。
6.干燥的沉淀物用5倍處理液(0.5mol/LCaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5、2%膠原酶)洗滌,3kr/min離心20min。
7.將沉淀移入帶塞的瓶中,加含0.5mol/L鹽酸胍、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇,2.0mol/L EDTA液4℃過(guò)夜。
8.3kr/min離心20min,沉淀用蒸餾水洗滌2次。
9,沉淀物加入處理液(6mol/L尿素、0.1%SDS、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7),通過(guò)氮氧真空過(guò)夜,3kr/min離心20min。
10.沉淀再真空干燥,即為彈性蛋白。
提取粘連蛋白的基本原理是用NaCl脫氧膽酸鈉液提取血管壁中的粘連蛋白,再用高鹽除去雜質(zhì),然后進(jìn)一步用Sephacryl層析純化,方法如下:
1.將動(dòng)脈血管壁組織加10倍體積處理液(0.05mol/lTris-HCL pH7.6、0.5%核酸酶),4℃攪拌20min,10kr/min離心10min。
2.沉淀用含0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、10%甲醇液,洗滌2次,10kr/min離心10min。
3.沉淀物中,加40倍體積處理液(0.05mol/lTris-HCl pH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/LNaCl,)4℃過(guò)夜后,10kr/min離心10min。
4.上清用PEG6000濃縮,最后加入已平衡好的SephacrylS-3000層析柱上,用0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%NaCl洗脫,第一峰即為粘連蛋白。