一、常用動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的比較
動(dòng)脈粥樣硬化模型所用的動(dòng)物有鼠、兔、豬、狗、猴,依上述理想動(dòng)物模型的要求最常用的是兔、豬和鼠f1411.cn/shouyi/。各種動(dòng)物誘導(dǎo)方法和形成特征的差異,見表22-1。
表22-1 動(dòng)脈粥樣硬化模型的種類
動(dòng)物種類 | 疾病誘導(dǎo)方法 | 特征 |
鴿 | 自然發(fā)生,或高脂飲食 | |
鼠 | 高脂膳食 | 高脂血癥,肥胖 |
大白兔 | 高脂膳食 | 高脂血癥,肥胖 |
血栓性血管壁損害 | 纖維增厚,粥樣硬化 | |
新西蘭兔 | 非剝離性內(nèi)皮損害 | 細(xì)胞纖維內(nèi)膜增厚 |
進(jìn)行性病變,內(nèi)膜增厚 | ||
豬 | 高脂膳食,壁損害 | 極似人類病變 |
狗 | 高脂膳食 | |
猴 | 高脂膳食 | 好發(fā)冠狀動(dòng)脈硬化 |
二、動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型制作過程
主要介紹豬和兔兩種動(dòng)物模型的制作過程。因其容易f1411.cn/zhuyuan/獲得、價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單,常為首選動(dòng)物。
1.豬的動(dòng)物模型
健康雄性中國小型豬,按統(tǒng)計(jì)學(xué)需要,自定數(shù)量。5~6月齡,稱其體重并記錄,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組數(shù)量相等,單籠飼養(yǎng),對(duì)照組只給基礎(chǔ)飼料,實(shí)驗(yàn)組基礎(chǔ)飼料每只動(dòng)物按25g·kg-1/d分兩次給予,上午在少量基礎(chǔ)飼料中拌入10%蛋黃粉和1.2%膽固醇,待吃完后再添足飼料。每月根據(jù)體重變化情況調(diào)整飼料量。兩組均自由攝水。為使動(dòng)脈粥樣硬化模型更接近人的病變,可采用間接飼養(yǎng)法,于第17周停喂膽固醇和蛋黃粉4周,到第21周再恢復(fù),并不再調(diào)整飼料量,直至第29周。
2.兔的動(dòng)物模型
兔可選日本大白兔或新西蘭白兔(常用作內(nèi)膜剝脫造型)。8周齡或成年兔,稱其體重記錄,隨機(jī)分組,單籠飼養(yǎng)。每日給膽固醇1.5g,上午以少量基礎(chǔ)飼料拌食,待吃完后,再添足基礎(chǔ)飼料(每日每只120g),對(duì)照組則只供基礎(chǔ)飼料,兩組均自由攝水,飼養(yǎng)10周。
以上均為高脂膳食法,此外還有一種較常見的造型法是剝脫內(nèi)膜法,其操作是選用我國的大耳白兔,每天只給0.5g膽固醇和大油1.5g,蛋黃5g,1周后經(jīng)右股淺動(dòng)脈,將3.5F球囊擴(kuò)張導(dǎo)管插至腹主動(dòng)脈20cm,球囊充液膨脹至2個(gè)大氣壓緩慢拉出,反復(fù)3次。
三、相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)
動(dòng)脈粥樣硬化的模型檢測(cè),大體包括病理形態(tài)學(xué)檢查,免疫組織化學(xué)檢查以及生化檢查三個(gè)方面。
1.病理形態(tài)學(xué)觀察
為了對(duì)比,豬在14~29周,兔在5~10周,處死兩組動(dòng)物(每周各一只),作飼養(yǎng)過程的經(jīng)過觀察。
(1)肉眼觀察主動(dòng)脈沿縱軸剪開,蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合染色,投影格子計(jì)數(shù)法分別計(jì)算每條主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積,胸、腹主動(dòng)脈內(nèi)膜面積以及蘇丹Ⅲ、Ⅳ染色陽性的脂質(zhì)條紋及隆起的纖維斑面積,求出各類病變面積百分比。冠狀動(dòng)脈自心臟剝下,沿縱軸切開,蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合液染色,按上述方法計(jì)算每條冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜及其病變面積,求出病變面積百分比。在實(shí)驗(yàn)組(豬)14周時(shí)脂質(zhì)條紋面積和纖維斑面積的百分比分別是9.64%和1.56%左右。冠狀動(dòng)脈在主支近端1/3處可見纖維斑。
(2)光鏡觀察從胸主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈典型病變處分別取材,常規(guī)石蠟切片,厚4μm,HE染色。用目鏡測(cè)微尺于200倍鏡下測(cè)量動(dòng)脈纖維斑或脂質(zhì)條紋的最大厚度及中膜厚度,求其厚度比值,兩組的值應(yīng)有顯著的差異。Masson染色片,光鏡下400倍計(jì)數(shù)三個(gè)視野的腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈左前降支纖維斑內(nèi)胞漿紅染的梭形細(xì)胞(視為平滑肌細(xì)胞)數(shù)。其值在兩組間亦應(yīng)有顯著的差異。此外,尚可在實(shí)驗(yàn)組見到內(nèi)膜缺損或裂隙。
(3)電鏡觀察動(dòng)脈處死后迅速取材(部位同光鏡),2.5g戊二醛及1%鋨酸雙重固定,常規(guī)制備樣品,以超薄切片機(jī)切片,乙酸鈉,檸檬酸鋁染色,透射電鏡觀察。掃描電鏡樣品經(jīng)逐級(jí)酒精脫水,臨界點(diǎn)干燥,鍍膜后觀察。在動(dòng)物模型組應(yīng)見到內(nèi)皮細(xì)胞變性壞死脫落,見到髓磷脂小體,細(xì)胞間連接變直變寬,內(nèi)皮下間隙擴(kuò)大,有較多的平滑肌細(xì)胞(SMC)和泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)密集成群分布的大脂滴和膽固醇結(jié)晶,結(jié)晶使細(xì)胞核移位,胞體腫大,部分泡沫細(xì)胞崩解,如圖22-1所示。線粒體腫脹變性,多數(shù)SMC胞漿內(nèi)充滿大量細(xì)胞器(粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體等)。但肌絲成分較少,間質(zhì)可見彈力纖維增生,細(xì)胞外脂質(zhì)沉積。
圖22-1 猴大動(dòng)脈硬化灶電鏡圖
喂飼一年形成的高膽固醇血癥猴的大動(dòng)脈呈高度動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(fattystreak)表面,內(nèi)皮細(xì)胞呈復(fù)雜的凸凹不平。一部分細(xì)胞接合分離、巨噬細(xì)胞祼落、血小板粘著凝集。
2.免疫組化定性定位觀察
目前市場(chǎng)上有多種免疫組化所需的抗原抗體提供,針對(duì)LDL的動(dòng)脈粥樣硬化斑可采用組化分析,用相應(yīng)的LDL抗體為第一抗體的PAP法觀察LDL在動(dòng)脈粥樣硬化病灶內(nèi)的分布。LDL免疫活性陽性的顆粒主要分布在泡沫細(xì)胞周邊,在纖維斑塊內(nèi),LDL顆粒呈彌漫性分布,在病灶深部?jī)?nèi)彈力板附近,有大量LDL顆粒聚集成帶狀。
3.生化指標(biāo)檢測(cè)
在動(dòng)物飼養(yǎng)全過程中,每周應(yīng)進(jìn)行一次血脂測(cè)定?稍诙轨o脈取血或心臟直接抽血。常測(cè)指標(biāo)有血清總膽固醇(TC),某油三酯(TG),低密度脂蛋白(LDL),高密度脂蛋白(HDL),載脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ),載脂蛋白B(ApoB)等,其動(dòng)物模型,除ApoAⅠ和HDL外,其他各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較出現(xiàn)不同程度的升高,尤其以TC、LDL、ApoB最為顯著。此外,血小板膜流動(dòng)性(PMF)及丙二醛(MDA)也可用作參考指標(biāo)。