醫(yī)學(xué)論文范文:存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒對化療藥物抑癌作用的影響

[14] Ting Wang,Wenxiu Li,Yingjie Deng,et al.Preparation of submicron unilamellar liposomes by freeze�瞕rying double emulsions[J].Biochim Biophys Acta,2006,1758:222��231.【摘要】 目的 探討存活素siRNA表達(dá)質(zhì)粒(mU6/survivin質(zhì)粒)對化療藥物抑癌作用的影響。方法 采用MTT法檢測mU6/survivin質(zhì)粒與多種常規(guī)腫瘤化療藥物對乳腺癌MCF��7細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用。結(jié)果 比較單純化療藥物作用組的各相應(yīng)濃度點(diǎn)，siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/survivin與化療藥物順鉑、環(huán)磷酰胺、5�卜�尿嘧啶或秋水仙堿合用組對腫瘤細(xì)胞MCF��7的細(xì)胞增殖抑制率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);對靶向DNA藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5�卜�尿嘧啶的抗癌性能具有顯著的協(xié)同增強(qiáng)作用(二者合用效應(yīng)Q值均>1)，但對靶向微管的藥物秋水仙堿沒有相加作用(Q值<1)。結(jié)論 在解除腫瘤細(xì)胞中存活素功能的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物化療，可能是腫瘤治療的一個新的可行方向。

【關(guān)鍵詞】 存活素;siRNA;質(zhì)粒;化療藥物

Effect of survivin siRNA expression plasmid on anti�瞭umor role of chemotherapeutic drugsLI Li�瞤ing1, LUO Chao�瞦uan2, ZHANG Zhi�瞶hen1, LIANG Nian�瞔i1 (1. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)Abstract: Objective To study the influence of survivin siRNA expression plasmid on anti�瞭umor role of chemotherapeutic drugs. Methods The combined role of mU6/survivin plasmid and several chemotherapeutic drugs in the proliferation of MCF��7 cells was determined by MTT method. Results The combined use of mU6/survivin plasmid and cisplatin, cyclophosphamide, 5�瞗luorouracil or colchicine resulted in significant inhibition of MCF��7 cells compared with the single use of mU6/survivin plasmid or chemotherapeutic drugs (P<0.01). The synergistic effect was observed in the combination of pmU6/survivin and cisplatin, cyclophosphamide and 5�瞗luorouracil (Q>1) other than colchicine (Q<1). Conclusion The combination of chemotherapy and survivin deprival may be a novel regimen for cancer patients.

Key words: surviving; siRNA; plasmid; chemotherapeutic drug

腫瘤手術(shù)切除結(jié)合化學(xué)藥物的細(xì)胞毒性治療仍然是當(dāng)今腫瘤治療的主要手段，順鉑、環(huán)磷酰胺、5�卜�尿嘧啶(5�睩u)和秋水仙堿都是廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐的常規(guī)腫瘤化療藥物，但其藥效并不總是理想，腫瘤治療后伴隨而來的耐藥或多藥耐藥性(MDR)更是治療過程中難以克服的障礙。存活素特異性地表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，臨床數(shù)據(jù)顯示，存活素表達(dá)高低與腫瘤患者的存活率相關(guān)[1]。我們針對存活素基因設(shè)計和克隆的mU6/ Survivin siRNA表達(dá)質(zhì)粒[2]，能高效地剔降乳腺癌MCF��7細(xì)胞中的存活素mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)。本實(shí)驗運(yùn)用該質(zhì)粒剔降乳腺癌細(xì)胞MCF��7中存活素的表達(dá)，之后施以化學(xué)毒性藥物進(jìn)行治療，觀察順鉑、環(huán)磷酰胺、5�睩u和秋水仙堿在存活素被沉默之后的抗癌效果。

1 材料和方法

1.1 試劑

空載體mU6pro由美國Michigan大學(xué)Dave Tur�瞡er博士惠贈; ProFection 哺乳類轉(zhuǎn)染系統(tǒng)購自Promega公司; 5�睩u(≥99%)、環(huán)磷酰胺(≥99%)、秋水仙堿(99.6%)購自南京學(xué)子醫(yī)化研發(fā)中心;順鉑注射液(1 mg/mL)由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);乳腺癌細(xì)胞MCF��7為本科室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

MCF��7細(xì)胞生長于含15 %小牛血清、0.5 U/mL胰島素、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI��1640完全培養(yǎng)基中，置37℃，5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣法，操作按ProFection哺乳類轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega)試劑盒說明書進(jìn)行。pEGFP�睳1和mU6/survivin質(zhì)粒以1∶3的比例共轉(zhuǎn)染MCF��7細(xì)胞，在60 mm培養(yǎng)皿上轉(zhuǎn)染3 μg mU6/survivin質(zhì)粒, 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的效率來確定轉(zhuǎn)染效率均超過80%，空載體mU6pro轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照。

1.3 腫瘤化療藥物增敏性實(shí)驗

將細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)�；騧U6pro空載體12 h后，0.25%胰酶消化，按0.5×104/孔接種于96孔板，在37℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，分別加入DMSO或終濃度為10、20、40、80和160 g/L的順鉑、環(huán)磷酰胺、5�睩u、秋水仙堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h, MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。每孔加入10 μL 5 g/L MTT ，繼續(xù)溫育4 h，然后加入100 μL DMSO，裂解細(xì)胞15 min，酶標(biāo)儀讀取光密度值OD570nm/450nm。按下列公式計算細(xì)胞增殖抑制率：B=對照組OD值，A=實(shí)驗組OD值，抑制率=(1�睞/B)×100%。合用效應(yīng)用Q值來表示[3]，Q值=實(shí)測合并效應(yīng)/期望合并效應(yīng)=實(shí)測抑制率/(EA+EB�睧A×EB)，EA、EB分別代表質(zhì)粒、化療藥物單獨(dú)作用時的抑制率。Q值<1為拮抗，Q值=1為相加，Q值>1為增強(qiáng)。單純藥物作用組轉(zhuǎn)染空載體mU6pro+藥物，單純質(zhì)粒作用組轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒+DMSO，藥物質(zhì)粒合用組轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒+藥物。

1.4 DNA瓊脂糖電泳檢測DNA裂解實(shí)驗

轉(zhuǎn)染mU6/survivin質(zhì)粒36 h后，加入濃度為20 g/L的不同的腫瘤化療藥物,如順鉑、環(huán)磷酰胺、5�睩u或秋水仙堿等，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗3次，加50 μL細(xì)胞裂解液(1 % NP��40,20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris�睭Cl pH 7.5)處理10 s，1500 g離心5 min，獲得上清，重復(fù)裂解1次，合并上清。加10 μL 10 % SDS，2 μL 10 g/LRNase A,37℃水浴2 h, 加4 μL 20 g/L蛋白酶K,56 ℃水浴2 h,隨后加70 μL 10 mmol/L NH4Ac,600 μL無水乙醇沉淀DNA，4 ℃條件下15000 g離心15 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，照相。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)用(±s)%表示，Student's test確定組間統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果醫(yī)學(xué) 全在.線提供f1411.cn

2.1 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)順鉑對MCF��7細(xì)胞的細(xì)胞毒性

結(jié)果見表1。順鉑單藥能有效地抑制MCF��7細(xì)胞的生長，并隨著順鉑濃度升高，其細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)它與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時，比較順鉑單藥組各對應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖抑制率相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P<0.01)。計算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度的順鉑的二者合用效應(yīng)Q值，所有對應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值均>1，具有協(xié)同增強(qiáng)作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF��7細(xì)胞中對順鉑誘導(dǎo)的DNA裂解沒有影響。表1 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)順鉑對MCF��7細(xì)胞的生長抑制 與順鉑單藥組對應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：^P<0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：△P<0.01。

2.2 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抑癌作用

結(jié)果見表2。在本實(shí)驗采用的濃度范圍內(nèi)，環(huán)磷酰胺單藥組對MCF��7細(xì)胞的生長抑制不明顯。但當(dāng)與mU6/survivin質(zhì)粒合用時，比較環(huán)磷酰胺單藥組各對應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P<0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖抑制率(21.16±1.60)%相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。計算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度環(huán)磷酰胺的二者合用效應(yīng)Q值，所有對應(yīng)濃度點(diǎn)的Q值均>1，具有增強(qiáng)協(xié)同作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF��7細(xì)胞中對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的DNA裂解沒有影響。

2.3 mU6/Survivin質(zhì)粒增強(qiáng)5�睩u的抑癌作用

結(jié)果見表3。5�睩u單藥能有效地抑制MCF��7細(xì)胞的生長。當(dāng)5�睩u與mU6/Survivin質(zhì)粒合用時，比較5�睩u單藥組各對應(yīng)濃度點(diǎn)，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P<0.01);與mU6/Survivin單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率相比較，其細(xì)胞增殖抑制率明顯增大(P<0.01)。計算mU6/Survivin質(zhì)粒與不同濃度5�睩u的二者合用效應(yīng)Q值，除10 g/L濃度點(diǎn)外，其余各濃度點(diǎn)Q值均>1，具有協(xié)同增強(qiáng)作用。DNA電泳結(jié)果顯示mU6/Survivin質(zhì)粒在MCF��7細(xì)胞中對5�睩u 誘導(dǎo)的DNA裂解沒有影響。表2 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)環(huán)磷酰胺對MCF��7細(xì)胞的生長抑制與環(huán)磷酰胺單藥組對應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：^P<0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：△P<0.01。 表3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)5�睩u對MCF��7細(xì)胞的生長抑制與5�睩u單藥組對應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：^P<0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：△P<0.01。表4 siRNA表達(dá)質(zhì)粒mU6/Survivin加強(qiáng)秋水仙堿誘導(dǎo)的MCF��7細(xì)胞的生長抑制 與秋水仙堿單藥組對應(yīng)的各濃度點(diǎn)比較：^P<0.01;與pmU6/survivin單質(zhì)粒組比較：△P<0.01。

2.4 mU6/Survivin質(zhì)粒對秋水仙堿的腫瘤細(xì)胞增殖抑制

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