醫(yī)學(xué)論文范文:RNA干擾抑制Survivin表達(dá)對人喉癌細(xì)胞藥物敏感性的影響

應(yīng)用化學(xué)藥物或γ�采渚�治療是目前常見的腫瘤術(shù)后治療手段。而逃避凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和藥物抵抗的重要機(jī)制[1]。如何能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性并誘導(dǎo)其凋亡就成了目前在腫瘤治療上非常重要的研究課題之一。Survivin是人體基因組中一種重要的腫瘤特異性基因，它明顯抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并在促進(jìn)癌細(xì)胞生長中起重要作用[2]。本實驗通過RNA干擾技術(shù)抑制人喉癌細(xì)胞Survivin的表達(dá),并檢測干擾后腫瘤細(xì)胞HEP��2對化療藥物敏感性的改變,探討Survivin對人喉癌細(xì)胞化療藥物敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人喉癌HEP��2細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞所,置于10%新生小牛血清RPMI��1640培養(yǎng)基中,內(nèi)加青霉素1×105 U/mL，鏈霉素100 mg/mL，5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建：具有互補(bǔ)序列能夠編碼短發(fā)卡RNA(shRNA)的雙鏈寡核苷酸模板DNA由上�？党晒�司合成。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA的作用靶點為人Survivin mRNA 94-112位核苷酸(GeneBank NO:NM��001168)。干擾序列為: TTCAAGAGA,AAGAACTCT;陰性對照是雙鏈寡核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA，此序列不與任何人類基因序列同源。

1.2 實驗分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

實驗分為4組：空白對照組，未轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組(轉(zhuǎn)染液中僅含脂質(zhì)體無siRNA),陰性對照組(轉(zhuǎn)染液加入空質(zhì)粒pRNAT�睳egative),pRNAT�睸urvivin組(轉(zhuǎn)染液加入重組pRNAT�睸urvivin質(zhì)粒)。將人喉癌HEP��2細(xì)胞分4組用Lipofectin�睺M2000(美國Invitrogene公司)介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

RT�睵CR檢測HEP��2細(xì)胞中Survivin mRNA的表達(dá)：分別收集轉(zhuǎn)染24、48、72 h細(xì)胞，使用Trizol (美國Invitrogene公司) 提取細(xì)胞總RNA,步驟按說明書。RT�睵CR法檢測在siRNA干預(yù)下Survivin基因mRNA表達(dá)的改變。引物上游序列為：5′�睪GC ATGGGTGCCCCGACGTT��3′;下游為：5′�睞GAGGCCTCAATCCATGGCA��3′。以Survivin與β�瞐ctin條帶的積分吸光度(A)比值表示Survivin mRNA的相對含量。

1.3 Western blot檢測Survivin蛋白的表達(dá)量

收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，離心后取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度，聚丙烯酞胺凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，與Survivin抗體(美國SantaCruz公司)結(jié)合，之后用辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗結(jié)合，ECL法顯色后照相。最后以image�瞤roplus 4.5圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值,以此反映Survivin蛋白的表達(dá)程度。

1.4 MTT法檢測化療藥物對各組細(xì)胞的生長抑制

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