自從上世紀(jì)末Eizzero和Salomon首先在胃粘膜發(fā)現(xiàn)螺旋形細(xì)菌以來(lái)，許多學(xué)者對(duì)這種細(xì)菌做了研究，都未能揭示其病理學(xué)意義。直到1983年和1984年，Marshall和Warren從組織上在胃炎和胃腸道疾病患者的胃粘膜發(fā)現(xiàn)彎曲菌（CLO)，在微需氧條件下培養(yǎng)出CLOs，命名為幽門彎曲菌（Campylobacter pylori-CP)，后更名為幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp)并證實(shí)Hp與慢性胃炎和消化性潰瘍密切相關(guān)，可能為其病原體。此后，Hp引起胃腸學(xué)家、病理學(xué)家和微生物學(xué)家們的極大興趣。經(jīng)過(guò)十多年的努力，Hp的實(shí)驗(yàn)室診斷從組織學(xué)、微生物學(xué)、超微結(jié)構(gòu)檢查、尿素酶快速診斷發(fā)展到13C與14C尿素呼吸試驗(yàn)，血清學(xué)免疫抗體檢測(cè)和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。超微結(jié)構(gòu)檢查證實(shí)了Hp是慢性胃炎的病原體，尿素酶呼吸試驗(yàn)和血清免疫抗體檢測(cè)和PCR可作為內(nèi)窺檢查前的篩選，有利于Hp流行病學(xué)，發(fā)病機(jī)理、臨床治療和藥物療效評(píng)定研究。
1 病史詢問(wèn)和體檢
詳細(xì)的病史可發(fā)現(xiàn)感染的來(lái)源或和胃炎“已知的”原因或彎曲菌感染的關(guān)系。主要詳細(xì)詢問(wèn)動(dòng)物接觸史、旅行、食物、口腔衛(wèi)生、吸煙習(xí)慣、酒精消費(fèi)量和藥物（抗酸制劑藥量)。特別是患者的詳細(xì)病史和癥狀（上腹痛、惡心和燒心感)及詳細(xì)的上腹部觸診。
2 內(nèi)窺鏡檢查
內(nèi)窺鏡檢查前至少禁食4h，仔細(xì)檢查胃和十二指腸后進(jìn)行常規(guī)活檢，從離幽門2cm～5cm內(nèi)的竇部或離局灶性損害一定距離的粘膜活檢5塊標(biāo)本。當(dāng)胃粘膜有炎證時(shí)應(yīng)從潮紅的區(qū)域活檢。2塊立即固定于福爾馬林磷酸鹽緩沖液送組織學(xué)檢查，另2塊置于冷卻的壓氧運(yùn)送液，在1h內(nèi)送微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。最后一塊插入“CLO—test box（幽門螺桿菌試劑盒)通過(guò)尿素酶活性檢Hp。活檢標(biāo)本必要時(shí)可送超微結(jié)構(gòu)檢查。根據(jù)病灶和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌部梢詮奈傅缀臀阁w分別活檢。
3 組織學(xué)檢查
活檢標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋切片后，選用Warthin－Starry、HE，GiemSa、吖啶橙、Gimenez，Brown-Hopps卡寶品紅染色法進(jìn)行染色，然后在光學(xué)顯微鏡或電鏡下觀察Hp的形態(tài)、數(shù)量和分布。Warthin－Starrg銀染色法是經(jīng)典的最常用的Hp染色法。Hp是黑色顆粒狀外觀，可與銀沉淀顆粒混淆。Giemsa染色時(shí)Hp外觀平滑呈純紫色。雖有背景染色，但細(xì)菌形態(tài)清晰、染色單一易辨認(rèn)。Brown－Hopps染色能極清楚地觀察胃腔內(nèi)粘液（黃色或稻草色)里的細(xì)菌（紫紅色)，確定粘液里和粘液外細(xì)菌的相對(duì)密度和粘液層的厚度，有利于估計(jì)入侵細(xì)菌的數(shù)量，吖啶紅是一種能與核酸結(jié)合的熒光色素。Hp在表面粘液層腺體表面呈淡桔紅色熒光，某種情況下，也可見(jiàn)于細(xì)胞內(nèi)粘液。吖啶橙可以更好地鑒定Hp的特征性形態(tài)學(xué)。
高倍顯微鏡下，Hp為弧形成螺旋狀彎曲樣細(xì)菌。可根據(jù)Hp分布的數(shù)量和密度進(jìn)行半定量測(cè)定，Marshall將Hp感染分為四級(jí)：0級(jí)：無(wú)特征性細(xì)菌；Ⅰ級(jí)：仔細(xì)尋找偶有細(xì)菌發(fā)現(xiàn)；Ⅱ級(jí)：大多數(shù)高倍視野發(fā)現(xiàn)散在分布的或偶有成叢的細(xì)菌；Ⅲ級(jí)：大多數(shù)高倍視野發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)菌。電子為微鏡下，Hp是一種長(zhǎng)3μm，寬約0.5μm彎曲細(xì)長(zhǎng)或螺狀細(xì)菌，包膜光滑，有4根從細(xì)菌一端發(fā)出的鞘型鞭毛，每根鞭毛有一個(gè)終球，每個(gè)極沒(méi)有明顯的陷窩壓跡。鞭毛和終球稱為漿。Hp單一或成叢地分布在胃上皮細(xì)胞腔面，包括胃陷窩，常位于粘液深層，接近胃竇上皮細(xì)胞平滑膨出的胞漿膜。
4 微生物學(xué)檢查
活檢標(biāo)本先涂片革蘭色觀察Hp，其余組織研碎后接種在綿羊血瓊脂或巧克力瓊脂，最理想的培養(yǎng)或含萬(wàn)古毒素6mg/L，萘啶酸20mg/L，二性毒素2mg/L，可抑制污染細(xì)菌而不抑制Hp生長(zhǎng)。Hp需在微需氧條件（CO210％，O25％)溫度37℃下培養(yǎng)5d～7d，出現(xiàn)典型Hp菌落為陽(yáng)性、7d后幼稚菌不生長(zhǎng)為陰性。Hp菌落呈直徑1mm，沒(méi)有色素的透明薄層。涂片觀察可見(jiàn)Hp為直徑約0.5μm，長(zhǎng)度2.5μm，外觀1或2個(gè)波長(zhǎng)的螺旋體。某些細(xì)菌的鞭毛可見(jiàn)于兩端，在陰性染色劑中有球根狀尖端。在人工介質(zhì)中，細(xì)菌常比新鮮組織革蘭染色中所見(jiàn)的Hp大，彎曲度較小。
化生試驗(yàn)：氧化酸＋，觸酶＋，H2S＋，尿素酶－，吲哚－，硝酸鹽－，不發(fā)酵葡萄糖。對(duì)萘啶酸耐藥。DNA鹼基分析鳥甙＋胞嘧啶含量為36mol％，螺桿菌范圍的值。
5 幽門螺桿菌尿素酶快速診斷
Morriset al將一塊胃或十二指腸活檢標(biāo)本插入小塊尿素瓊脂，由于尿素酶的作用，改變瓊脂的pH值，使瓊脂由黃色變?yōu)榉奂t色，陰性者顏色不變。應(yīng)用CLO—test，67％Hp感染在15min內(nèi)診斷，72％1h內(nèi)，90％3h內(nèi)診斷。Varira et al改良后4h RUT Hp檢出特異100％，敏感性89％。對(duì)竇部活檢標(biāo)本的特異性和敏感性分別為100％和92％。假陽(yáng)性結(jié)果可能由于標(biāo)本里的細(xì)菌數(shù)量少。他們指出，4h RUT陽(yáng)性即可開(kāi)始治療。Arrinf et al報(bào)告Hp的1min尿素酶試驗(yàn)結(jié)果，21例標(biāo)本，19例陽(yáng)性，沒(méi)有假陰性報(bào)告結(jié)果。上述結(jié)果表明，Hp感染的尿素酶快速診斷是一種方便可靠的方法。
6 13C-尿素呼吸試驗(yàn)
Grahamet al利用Hp內(nèi)源性高效尿素酶活性作為診斷Hp的非入侵性試驗(yàn)。試驗(yàn)前先口服13C－尿素、尿素分解產(chǎn)物的13CO2出現(xiàn)在Hp感染患者呼出的CO2中，持續(xù)時(shí)間＞100min。26例中，每一例陽(yáng)性呼吸試驗(yàn)，粘膜活檢標(biāo)本培養(yǎng)或Warthin－Starry銀染色陽(yáng)性，或二者都陽(yáng)性。14例慢性呼吸試驗(yàn)提示Hp感染者中，13例銀染色發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，13例培養(yǎng)陽(yáng)性。Hp感染被發(fā)現(xiàn)于20％正常無(wú)癥狀志愿和25％非潰瘍性消化不良志愿者。12例十二指腸潰瘍患者中，僅10例發(fā)現(xiàn)Hp感染。2例呼吸試陰性潰瘍患者，即沒(méi)有培養(yǎng)性，也沒(méi)有組織學(xué)陽(yáng)性。
714C－尿素呼吸試驗(yàn)
G．D．Bell et al15敘述了14C－尿素呼吸試驗(yàn)，方法如下；夜間禁食后患者飲用350ml液體和20ml水加0.4MBg14C尿素（Amersham International)，2h內(nèi)定期收集呼吸標(biāo)本。應(yīng)用液體閃爍記數(shù)器測(cè)定呼出CO2中的14C，計(jì)算曲線以下區(qū)域、用作表示14CO2累積排出量。14CO2迅速出現(xiàn)在Hp陽(yáng)性患者的呼氣中。高峰排出在攝入14C尿素后的10min—60min；非常低但易于發(fā)現(xiàn)。在對(duì)照組中記錄14C尿素�；颊咴谌魏�10min標(biāo)本產(chǎn)生75％以上所給劑量每mmol的CO2劑量×體重。所有Hp陽(yáng)性患者在第一小時(shí)至少有一個(gè)標(biāo)本產(chǎn)生超過(guò)1.19，14C尿素呼吸試驗(yàn)可靠地區(qū)別Hp感染或不受Hp感染的患者。鉍劑治療因其對(duì)Hp的殺滅作用在14CO2呼吸試驗(yàn)中曲線明顯下降。
13C是非放射性同位素，無(wú)放射性，因測(cè)驗(yàn)時(shí)病人無(wú)不適感覺(jué)，故幼兒可受試，但使用測(cè)定13CO2回收所需要的大型質(zhì)譜儀和試劑較昂貴，在地區(qū)綜合醫(yī)院是不可能接受的。而14C尿素呼吸試驗(yàn)需要閃爍計(jì)數(shù)器，價(jià)廉易被接受，但14C有放射性，而且半衰期很長(zhǎng)，不宜應(yīng)用于兒童和孕婦。因此，非入侵性14C尿素呼吸是一種簡(jiǎn)便，價(jià)廉和可以監(jiān)測(cè)各種藥物對(duì)Hp感染作用的方法。
8 DNA位點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)胃內(nèi)Hp
Vanden berg et al研究了非放射性DNA位點(diǎn)雜交（DISH)探針（probtocol)，即應(yīng)用輔酶R化的Hp DNA作為探針檢出常規(guī)包埋的胃活檢標(biāo)本里Hp的DNA。在從一例58歲復(fù)發(fā)性慢性活動(dòng)性胃炎的女性所獲得的連續(xù)標(biāo)本中，Hp探針和細(xì)菌雜交、除一個(gè)標(biāo)本例外，當(dāng)組織學(xué)上無(wú)可見(jiàn)的細(xì)菌時(shí)，雜交陰性。在一個(gè)無(wú)可見(jiàn)的Hp單一活檢標(biāo)本和胃竇表面進(jìn)行雜交，而和異質(zhì)性探針的對(duì)照雜交仍陰性。從一塊同時(shí)獲得的活檢標(biāo)本，Hp培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性。雖然DISH比HE、銀或Giemsa染色更復(fù)雜，但更敏感，其優(yōu)點(diǎn)，①非常容易發(fā)現(xiàn)Hp，尤其當(dāng)切片無(wú)對(duì)照染色，甚至Hp少量存在時(shí)；②雜交細(xì)菌明確地鑒定為Hp，而不僅僅鑒定為Hp；③從同一區(qū)域的胃竇獲得的標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性，DISH在上皮表面發(fā)現(xiàn)Hp的DNA雜交而組織學(xué)上在這人位置來(lái)證實(shí)Hp存在。
9 Hp的血清學(xué)研究
1986年Wyatt et al首先在54例活檢標(biāo)本應(yīng)用IgA、IgG和IgM免疫過(guò)氧化酶染色研究活體宿主免疫球蛋白包裹的Hp。IgA包裹的Hp見(jiàn)于所有病例的活動(dòng)性胃炎。其中60％的標(biāo)本上皮內(nèi)沒(méi)有嗜中性細(xì)胞，許多非活動(dòng)性胃炎IgG或IgM包裹或二者都包裹的Hp與胃炎活動(dòng)相關(guān)，在沒(méi)有嗜中性細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)本中罕見(jiàn)。IgA通過(guò)干擾細(xì)菌粘著在上皮表面，保護(hù)粘膜�；顒�(dòng)性胃炎和IgM和IgG包裹的Hp的相關(guān)性是Hp引起炎癥反應(yīng)的確鑿證據(jù)。Hp在所有年齡和所有分級(jí)胃炎患者的感染提示，一旦細(xì)菌種植后便可以永久存留。因此宿主免疫反應(yīng)對(duì)于根除細(xì)菌是無(wú)效的。Hp在胃陷窩深部的隱藏處，可以避免與至少足以被免疫過(guò)氧化酶技術(shù)發(fā)現(xiàn)的濃度的免疫球蛋接觸。在活檢標(biāo)本中Hp存在于三個(gè)部位：粘膜表面、胃陷窩的較上部和深部。根據(jù)Hp的數(shù)量和密度可進(jìn)行半定量測(cè)定，共分為+～++++四級(jí)。＋：染色后偶然發(fā)現(xiàn)Hp；++：在粘膜表面和陷窩的所有高倍視野發(fā)現(xiàn)Hp；+++：在粘膜表面和陷窩的所有高倍視野發(fā)現(xiàn)Hp；++++：在所有視野發(fā)現(xiàn)大量的Hp。這些值加上細(xì)菌種植密度獲得1至12＋的級(jí)數(shù)范圍。
Musgroveet al應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELI—SA)技術(shù)發(fā)現(xiàn)抗HpIgG抗體。所有胃炎和感染Hp的患者滴度≥640；39例沒(méi)有胃炎和細(xì)菌的患者中，8例（21％)滴度相似。因此，Hp感染和IgG抗體滴度升高相關(guān)。1989年Bolton和Hatchinson評(píng)價(jià)3種螺桿菌抗體抗原制劑，一種表面抗原（SA)，甘氨酸提取物（AGE)和尿素酶制劑（UP)。應(yīng)用常規(guī)間接酶聯(lián)免吸附法（SELISA)測(cè)定血清中IgG和IgA抗體。在感染Hp的患者，IgG抗體滴度升≥500，≥500，≥500吸附值分別表示SA，AGE和UP。AGE，SA和UP的IgG測(cè)定值分別為94％，92％和90％，與其余2種對(duì)照、Hp最敏感（92％)，其他兩種抗原制劑值為82％。在IgA測(cè)定中，UP特異性最高（93％)，UPIgA測(cè)定真陽(yáng)性預(yù)測(cè)值比其他兩種抗原制劑79％高。胃或十二指腸潰瘍患者SA抗體滴度升高為72％（IgG)和73％（IgA)；AGE抗體滴度高為75％（IgG)和63％(IgA)，UP抗體滴度升高為72％（IgG)和75％(IgA)。尿素酶制劑最敏感，預(yù)測(cè)值最高。在IgG—ELISA，特異性可轉(zhuǎn)為93www.med126.com％。因此，被選為ELISA試驗(yàn)的抗原制劑。這項(xiàng)研究提示IgG滴度的測(cè)定可做為內(nèi)窺鏡檢查前的篩選。
10 PCR技術(shù)檢測(cè)Hp
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)檢測(cè)Hp。PCR方法能快速、敏感、特異地檢測(cè)胃活檢www.med126.com標(biāo)本中Hp，對(duì)于研究Hp與上消化道疾病之間的關(guān)系，指慢抗菌藥物治療均具重要意義。陳一平等應(yīng)用PCR對(duì)Hp特異性尿素酶A基因進(jìn)行擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)可以檢測(cè)出10個(gè)Hp，加用非同位素地戈辛探針雜交，可以檢出單個(gè)Hp。用本法對(duì)100例胃鏡活檢標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)，其陽(yáng)性率達(dá)82％，而尿素酶水解試驗(yàn)，細(xì)菌涂片及培養(yǎng)的陽(yáng)性率分別為68％，46％，18％。尹洪波、姜琦應(yīng)用PCR對(duì)64例患者128分胃組織和胃液標(biāo)本中的Hp特異性尿素酶A基因進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性率分別為67.3％，45.3％和17.2％，胃液中涂片和培養(yǎng)的陽(yáng)性率分別為25.0％和4.7％。作者認(rèn)為，胃液標(biāo)本和組織標(biāo)本兩者PCR陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，這對(duì)臨床檢測(cè)的重復(fù)性和減少活檢的創(chuàng)傷性，有著一定的意義。
