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中國生物制品規(guī)程:凍干皮上劃痕用鼠疫活菌苗制造及檢定規(guī)程

本品系采用鼠疫菌弱毒菌株,經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防鼠疫。1 菌種1.1 菌種來源用弱毒的EV菌株,由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2 菌種檢f1411.cn/job/定凍干菌種在生產(chǎn)前每年需要檢查一次培養(yǎng)特性、生化特性、噬菌體裂解試驗及安全性。1.2.1 培養(yǎng)…

本品系采用鼠疫菌弱毒菌株,經(jīng)培育后凍干制成。用于預(yù)防鼠疫。

1 菌種

1.1 菌種來源

用弱毒的EV菌株,由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2 菌種檢f1411.cn/job/

凍干菌種在生產(chǎn)前每年需要檢查一次培養(yǎng)特性、生化特性、噬菌體裂解試驗及安全性。

1.2.1 培養(yǎng)特性

在瓊脂平皿上,37℃培育44~48小時之菌落應(yīng)為粗糙型,在肉湯中液面有薄菌膜,管底有沉淀物,肉湯透明。

1.2.2 生化特性

應(yīng)分解葡萄糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,石蕊牛乳輕度變紅,在甘油培養(yǎng)基內(nèi)不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

1.2.3 噬菌體裂解試驗

將EV菌種涂于瓊脂平皿上,加滴度為10-6以上的鼠疫噬菌體1滴,于28℃培育44~48小時,在噬菌體流過的地方應(yīng)無本菌生長。

1.2.4 安全試驗

用體重300~400g豚鼠3只,每只皮下注射120億菌(28~30℃培育44~48小時的培養(yǎng)物)。在注射后第6天解剖1只,第21天解剖2只,檢查注射部位、脾、肝、肺,并用脾、肝、肺及心血進行培育。其中心血和肺培育應(yīng)無本菌生長。肉眼檢查病變,注射部位可見充血,浸潤變?yōu)槟摨儯魏推⒖捎星鹫顮罱Y(jié)節(jié),肺部不應(yīng)有鼠疫特異病變?yōu)榘踩囼灪细瘛7尾咳缬酗@著病變時,應(yīng)用同量豚鼠復(fù)試,若仍有顯著病變時,菌種應(yīng)廢棄。

1.2.5 免疫力試驗

用體得200~250g的豚鼠10只,每只皮下注射70萬菌(28~30℃培育44~48小時的培養(yǎng)物)一次。于20~25天后進行攻擊,每只皮下感染鼠疫強毒菌200個MLD。。同時用3組豚鼠作對照,每組3只,各組豚鼠皮下分別注射0.5、1及2個MLD的毒菌。免疫組及對照組至少觀察25天。免疫動物存活不少于8只,而對照動物注射1個及2個MLD全部死亡時,免疫力試驗為合格。

1.3 菌種保存

菌種應(yīng)凍干保存,凍干菌種保存于2~8℃暗處。

2 菌苗制造

2.1 制造鼠疫活菌苗之實驗室在生產(chǎn)期間應(yīng)專用,不得作其他細菌工作,絕對禁止保存鼠疫毒菌。

2.2 制造用培養(yǎng)基

制造菌種可用pH6.8~ 7.2的厚氏瓊脂培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基。

2.3 原液制造

2.3.1 第1代菌種

啟開干燥菌種加入生理鹽水溶解后,接種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基上,于28~30℃培育44~48小時為第1代。放2~8℃保存可使用半個月。

2.3.2 第2代菌種

用生理鹽水將第1工菌種洗下,接種足夠量的種子瓶,于28~30℃培育44~48小時為第2代,供大批生產(chǎn)用。不得用第3代菌種生產(chǎn)。

2.3.3 大量接種

第2代菌種經(jīng)肉眼檢查無雜菌后,加入適量生理鹽水洗下菌苔,制成均勻的菌懸液,用此菌懸液接種培養(yǎng)瓶,于28~30℃培育44~48小時后,逐瓶肉眼檢查,有雜菌者廢棄。

2.3.4 采集

用由蔗糖、明膠、硫脲、味精及尿素組成的保護液洗下菌苔(洗菌前將凝固水倒去)或?qū)⒕稳肷鲜霰Wo液內(nèi),制成原液。每瓶原液均應(yīng)按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行純菌試驗,不得有雜菌生長。

2.3.5 合并、稀釋、分裝

用4層紗布或絹布將純菌試驗合格之原液過濾合并,按中國細菌濁度標準比濁后用保護液稀釋,使稀釋后每人份含菌數(shù)7億~9億。然后按10或20人份分裝于安瓿,并進行凍干。采集至凍干,原液不得超過7天,合并后的原液應(yīng)按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行純菌試驗。

2.4 菌苗分批

同一日培育的原液于同一次冷凍干燥者為1批。如1批有數(shù)瓶,應(yīng)分亞批。

3 凍干

菌苗分裝后應(yīng)立即在-30℃以下進行冷凍。干燥時間可根據(jù)水含量及活菌數(shù)來決定。干燥完畢后進行真空封口,亦可充氮封口。

4 成品檢定

4.1 物理性狀檢查

本品為白色或淡黃色疏松體。用真空測定器檢查安瓿應(yīng)為真空。菌苗水分含量不得超過3%。加入生理鹽水后應(yīng)在半分鐘內(nèi)溶解成均勻懸液。

4.2 濃度測定

菌苗經(jīng)稀釋后,按中國細菌濁度標準(7億/ml)測定濃度。皮上劃痕用菌苗每人份含菌數(shù)為7億~9億。

4.3 活菌數(shù)測定

由生產(chǎn)部門會同質(zhì)量檢定部門進行。每亞批取3支安瓿,加生理鹽水溶解后,混勻比濁,稀釋至10億/ml。再按10倍系列稀釋至10-6。用10-6稀釋度懸液接種5個平皿,每個平皿接種0.1ml。涂勻后放28~30℃培育2~3天,計算活菌數(shù)。凍干后活菌率不少于45%為合格。如低于45%時可復(fù)試,如仍不合格則該批菌苗應(yīng)廢棄。

4.4 純菌試驗

每批菌苗按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

5 菌落、菌形檢查

應(yīng)呈典型粗糙型菌落,涂片鏡檢,為革蘭氏陰性桿菌。

4.6 安全試驗

由生產(chǎn)部門會同質(zhì)量檢定部門進行。每亞批菌苗取2支安瓿,用生理鹽水溶解后,用體重300~400g豚鼠2只,每只皮下注射120億菌,第6天稱豚鼠體重(不應(yīng)比原體重減輕1/5以上)并取其中1只解剖,另1只觀察到21天解剖。檢查項目及要求均同1.2.4項。

4.7 免疫力試驗

每10批菌苗抽檢,10批以下者每3~5年至少檢查1次。由生產(chǎn)部門會同質(zhì)量檢定部門進行。用體重250~300g豚鼠10只,每只皮下注射5000萬菌,注射后20~25天以200個MLD的鼠疫毒菌進行皮下攻擊。同時有3組豚鼠作對照,每組3只,分別于各組豚鼠皮下注射0.5、1和2個MLD。各組動物于注射后,觀察25天。免疫動物活存不少于8只,而對照動物注射1個和2個MLD全部死亡時,免疫力試驗為合格。

5 保存與效期

應(yīng)保存于2~8℃暗處。自凍干后活菌數(shù)檢定合格之日起效期為1年。

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