醫(yī)學(xué)微生物學(xué):第三節(jié)　細(xì)菌的突變

遺傳型變異中常見的一種為突變（Mutation)，即細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生偶然的改變。一般突變會導(dǎo)致所編碼蛋白質(zhì)的改變，從而使細(xì)菌出現(xiàn)新的特性或失去原有的某些特性。細(xì)菌的自然突變率與其生物的自然突變相同，每106～108次細(xì)胞分裂發(fā)生一次。由于細(xì)菌每20～30分鐘分裂一代，故突變株相對較多。當(dāng)突變發(fā)生在DNA一對或少數(shù)幾對堿基引起改變時，稱為點突變。這類突變涉及堿基對的置換、增加或缺失。另一種類型的突變涉及大段DNA的改變?nèi)绮迦牖蛉笔�幾百個堿基對，稱為染色體畸變。在細(xì)菌中點突變較多見，但在大腸桿菌的染色體中曾發(fā)現(xiàn)有800～1400堿基對的插入，稱為插入順序(Insertion sequences)。

一、突變與選擇

由于細(xì)菌的突變所發(fā)生的表型變異必須在一定外界環(huán)境下才表現(xiàn)出來，因此對外界環(huán)境在突變中的作用曾發(fā)生過爭議。曾有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌與其他生物一樣，需經(jīng)過突變與外界環(huán)境條件選擇而出現(xiàn)突變株；然而也有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌生長繁殖迅速，外界環(huán)境可直接作用誘導(dǎo)出變異株。這一爭論直到1943年Luria與Delbrf1411.cn/sanji/uck進行了有名的變異試驗(Fluctuation test)后才初步獲得解決。變異試驗是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理設(shè)計的（圖5-1)。將一瓶對大腸桿菌噬菌體T1敏感的細(xì)菌培養(yǎng)后，稀釋至1，000細(xì)菌/ml,分別分至兩套試管系列。一套僅將細(xì)菌接種至一支大管培養(yǎng)基中，經(jīng)一段時間培養(yǎng)后，分別接種于數(shù)個平板。在平板中加入噬菌體，（如果出現(xiàn)耐噬菌體裂解的突變細(xì)菌株則在該平板上應(yīng)出現(xiàn)菌落)以篩選耐噬菌體的突變株菌落。另一套試驗為將細(xì)菌分別接種于數(shù)支小試管的培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時間后自每支試管吸取菌液各涂布接種一個加入噬菌體的平板，然后計數(shù)發(fā)生的突變耐噬菌體菌株菌落數(shù)。如果出現(xiàn)耐噬菌體菌株是因接觸噬體而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，兩套平權(quán)上出現(xiàn)的耐噬菌體菌株菌落數(shù)。如果出耐噬菌體菌株是接觸噬體而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，兩套平權(quán)上出現(xiàn)的噬菌體菌落數(shù)應(yīng)大體相等。如果系細(xì)菌自發(fā)突變則兩套平板上的耐噬菌體菌落數(shù)應(yīng)有顯著不同，因為在后一情況下，細(xì)菌分別在各支試管中各自在生長繁殖周期或早或遲可發(fā)生突變。突變發(fā)生早的突變株繁殖后出現(xiàn)的子代數(shù)必然多于突變株發(fā)生晚者，因此各平板上的菌落有的很多，有的則缺如。實驗結(jié)果證明兩套平板上耐噬菌體菌落數(shù)差異很大，從萬里證實細(xì)菌已自身發(fā)生為，而外界是條件僅起選擇作用。

圖5-1 細(xì)f1411.cn/shouyi/菌的變異試驗

然而，仍有學(xué)者對上述實驗的統(tǒng)計學(xué)意義特異議。1952年Lederberg設(shè)計了影印培養(yǎng)(Replica plating)（見圖5-2)，這一試驗證明細(xì)菌耐藥突變不是由抗菌藥物誘導(dǎo)師產(chǎn)生，而在未接觸抗菌藥物前已產(chǎn)生耐藥突變。其方法為將對鏈霉素敏感的大腸桿菌大量接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)后細(xì)菌在培養(yǎng)基上均勻的長出菌苔層，然后用滅菌的絲絨復(fù)蓋在一塊與平皿同樣大小的木塊上輕輕影印，使細(xì)菌菌落全部轉(zhuǎn)移到絲絨面上。另取含有鏈霉素的瓊脂培養(yǎng)平板，將絲絨面再印在其上，從而獲得與原始平板完全相同的復(fù)制平板。將此平板培養(yǎng)，耐藥的菌落出現(xiàn)后，通過比較，可從原始平板的相應(yīng)部位刮取菌苔轉(zhuǎn)種至液體培養(yǎng)基中，增菌后，重復(fù)制備原始平板與影印平板。經(jīng)過數(shù)次重復(fù)后，則可獲得一株完全沒有接觸過鏈霉素的高度耐鏈毒素的突變株，表現(xiàn)為原始平板上全部菌落與含鏈霉素平板上的菌落吻合。這一實驗雄辯地證明了鏈霉素僅起選擇作用。

二、基因突變類型

在明確了細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境條件僅起選擇作用后，學(xué)者們采用了一些選擇方法以獲得突變株，這些突變株的應(yīng)用對研究遺傳變異及開展有基因工程都很有幫助。大從數(shù)利用的突變型均為大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌，因這兩種細(xì)菌營養(yǎng)要求不高，僅需鹽、微量金屬離子及有限的氮、碳來源即可生長繁殖。未發(fā)生突變的菌株稱為野生型，而發(fā)生突變的菌株則根據(jù)選擇條件可分為：

1．營養(yǎng)缺陷型：突變后因某種酶的缺失需要額外添加某種營養(yǎng)成份方能生長繁殖者。一般用“+”代表能利用自然存在的某種成份或能合成某種成份的中間體，而“—代表不能合成該成份的菌株。如his-則代表組氨酸缺陷型，需在培養(yǎng)基中加入組氨酸。

2.抗性突變型:一般以S代表對化學(xué)藥物或抗生素敏感,r代表有抵抗力。如str8代表該菌株對鏈霉素敏感，在有鏈霉素存在時不能生長。這類突變型最易獲得，應(yīng)用亦廣。

3．發(fā)酵陰性突變型：突變后失去發(fā)酵某種糖的能力但仍能利用其他糖做為碳源。這是由于突變后失去能分解該糖的酶。由于乳糖發(fā)酵可用指示劑根據(jù)pH改變而顯示，故可Lac-（乳糖發(fā)酵陰性)突變株作為研究工具。

圖5－2　細(xì)菌影印培養(yǎng)試驗

4．條件致死性突變型：在某一條件下具有致死效應(yīng)，突變株不能生長，但在另一沒有致死效應(yīng)的條件下仍可生長。最常用者為溫度敏感性突變型。它們在親代能生長的溫度范圍內(nèi)特別是較高濕度（42℃)不能生長，但在較低溫度（25℃)則能生長。這種菌株稱為ts株。其發(fā)生的原因是某些酶的肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后，降低了酶的抗熱性。因此在較高溫度下不能生存。這種用溫度篩選突變株的方法比較簡便，應(yīng)用較多。

三、基因突變的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的機制包括：

1．堿基置換（Substitution)：包括兩種類型：轉(zhuǎn)換(Transition)是由嘌呤置換嘌呤或嘧啶置換嘧啶。顛換(Transversion)是指嘌呤置換嘧啶或嘧啶置換嘌呤。如堿基置換發(fā)生于編碼多肽的區(qū)，則因可影響密碼子而使轉(zhuǎn)錄、翻譯遺傳信息發(fā)生變化，因此可以出現(xiàn)一種氨基酸取代原有的某一種氨基酸。也可能出現(xiàn)了終止密碼而使多肽鏈合成中斷，不能形成原有的蛋白質(zhì)而完全失去某種生物學(xué)活性。

2．堿基的減少、增加與倒置：三種情況都可造成對密碼的錯誤閱讀。如DNA原有堿基順序為AAG，GAA，CGC，TGA，如失去第一個A，則成為AGG，AAC，GCT，GA，使原來編碼押肽由亮一組一丙一蘇氨酸改為半胱-亮-精-亮氨酸。這種突變導(dǎo)致的是密碼意義的錯誤，稱為移碼突變。移碼突變的影響范圍自突變點起直到末端整條結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，引起基因產(chǎn)物的變化比較嚴(yán)重，對生物活性的影響也較顯著。

3．堿基的互變異構(gòu)：四種堿基中的任何一種均可發(fā)生互變異構(gòu)，在作為模板時可引起互補堿基的改變。如當(dāng)胸腺嘧啶以正常形式（即酮基型)為模板時，配對的互補堿基為腺嘌呤；當(dāng)前者變?yōu)橄┐夹徒Y(jié)構(gòu)時，通過氫鍵配對的堿基可變?yōu)轼B嘌呤。（圖5-3)

圖5-3 堿基的互變異構(gòu)

細(xì)菌自發(fā)突變的發(fā)生原因可能是宇宙間普遍存在的短波輻射、熱及自然界存在的一些具有致突變作用的物質(zhì)。人工應(yīng)用理化因素可誘發(fā)突變者稱為誘變劑�；瘜W(xué)誘變劑包括核苷酸堿基的類似物如分子結(jié)構(gòu)類似胸腺嘧啶的5-溴尿嘧啶。烷化劑可改變堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)也是誘變劑。吖啶類染料可螯合入DNA的堿基對之間，引起DNA在復(fù)制過程中出現(xiàn)堿基對的插入或缺失。紫外線與X線是常用的物理誘變劑。紫外線可使鄰近的胸原嘧啶構(gòu)成雙體，引起DNA結(jié)構(gòu)的變化而致突變。