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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第五節(jié) 膠體金標(biāo)記物的制備

膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理,一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)呈電中性,此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小,但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大,處于一種微弱的水化狀態(tài),較易吸附于金顆粒的表面,由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表…

膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理,一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)呈電中性,此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小,但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大,處于一種微弱的水化狀態(tài),較易吸附于金顆粒的表面,由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面,形成一個(gè)蛋白層,阻止了膠體金顆粒的相互接觸,而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài),如果=低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)帶正電荷,膠體金帶負(fù)電荷,二者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀,常用牛血白蛋白,卵白蛋白,聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb S—400 (丙烯葡聚糖S—400)層析分離純化膠體金蛋白標(biāo)記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。

一、待標(biāo)記蛋白質(zhì)的準(zhǔn)備

(1)透析除鹽:蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì),不然過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的Zeta電位,影響蛋白質(zhì)的吸附,因此,標(biāo)記之前必須徹底除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的f1411.cn/rencai/鹽水(0.005mol/l NaCl , pH7.0)透析。

(2)去除蛋白質(zhì)中的沉淀:長(zhǎng)期低溫保存的蛋白質(zhì)或4較長(zhǎng)時(shí)間保存的抗體,特別是在濃度高于2mg/ml的情況下,很容易形成聚合物,聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響,因此,標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液,調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg./ml即可用于標(biāo)記。

二、膠體金pH值的調(diào)整

膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否,取決于pH值,一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合,因此,標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3,需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1n HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭,因此,一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可。

幾種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值見(jiàn)表5-4。

表5-4 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值如下

蛋白質(zhì)pH
抗體(γ球蛋白)9.0
親合層析的IgG7.6
單克隆抗體8.2
F(ab')27.2
SPA(葡萄球菌蛋白)6.0
蓖麻子植物凝血素Ⅰ8.0
蓖麻子植物凝血素Ⅱ8.0
花生凝集素6.3
Helix pomatia lectin7.4
大豆凝集素6.1
Lens Culinaris lectin6.9
Lotus Tetragonolobus lectin6.3
荊豆凝集素6.3
Bandeirae simplicifolia lectin6.2
過(guò)氧化物酶8.0
類卵粘蛋白4.8
血漿銅蘭蛋白7.0
α-胎球蛋白6.5
小牛血清白蛋白6.5
牛血清白蛋白5.5
牛血球白蛋白結(jié)合肽4.5
牛血清白蛋白結(jié)合胰島素5.3
霍亂毒素6.9
傷風(fēng)毒素6.9
DNAase6.0
RNAase9.0
低密度脂蛋白5.5
α2-巨球蛋白6.0
抗生物素蛋白(親合素)10.0
鏈霉抗生物素蛋白6.6
麥胚凝集素9.9

三、待標(biāo)記蛋白質(zhì)最適穩(wěn)定量的測(cè)定

(1)光電比色法:制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液(1ml),分別加入5ml膠體金中,迅速混勻,然后,各加入1ml 10% NaCl溶液,搖勻,靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小,OD在520~580nm之間測(cè)定,以O(shè)D值為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線,取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最www.med126.com適穩(wěn)定量為45μg/ml。

圖5-2 蛋白最適穩(wěn)定量示意圖

(2)目測(cè)法:以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例,將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后(由5μg~45μg另設(shè)對(duì)照管),各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中,5min后,在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉,依表5-5順序進(jìn)行。

表5-5 具體的做法是按表內(nèi)進(jìn)行

管數(shù)12345678910
膠體金(ml)1111111111
蛋白質(zhì)(μg)510152025303540450
10%NaCl(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1

①當(dāng)分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。

②沒(méi)有加入蛋白質(zhì)的管為對(duì)照管。

③小于5nm顆粒的膠體金溶液,每個(gè)管內(nèi)應(yīng)加入5μl33%的雙氧水,否則有不變藍(lán)色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管,即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象,而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實(shí)際用量。

四、蛋白質(zhì)的膠體金標(biāo)記

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下:

(1)根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。

(2)在電磁攪拌下,將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中(pH已調(diào)至PI超過(guò)0.5pH),加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入,1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。

(3)在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%,或加入3%聚乙二醇(PEg MW20000)使其終濃度為0.05%, 我們對(duì)比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果,BSA穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金,放在4達(dá)2年半仍然保持良好性能,而用PEG穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金放在4℃1年左右就有分層現(xiàn)象,而且染色效果顯著下降。因此,我們認(rèn)為最好還是用BSA作穩(wěn)定劑。

(4)將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中,兩頭扎緊,放入蔗糖或硅膠中濃縮,濃縮到原體積的1/10量,濃縮完畢后純化。離心法純化時(shí),不要濃縮。

五、膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化

標(biāo)記好的免疫金探針必須經(jīng)過(guò)純化處理以后才能用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。純化的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì),未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。

(一)調(diào)整與超速離心法

(1)將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4離心15min,吸出上清,棄去沉淀,以去除大的聚合物。

(2)一般在10nm以上所標(biāo)記的膠體金均可在調(diào)整離心機(jī)上離心,小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心,在4離心1h左右,棄上清,將沉淀以原體積的0.02mol./l TBSpH8.2(內(nèi)含1%BSA,0.05%疊氮鈉)溶解,重復(fù)離心2~3次,沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存?zhèn)溆。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑,上述粗提制劑可用10%~30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心,分帶收集不同大小顆粒的膠體金標(biāo)記蛋白制劑。

幾種免疫金探針離心所用轉(zhuǎn)速(見(jiàn)表5-6),離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速見(jiàn)表5-7,膠體金的OD值見(jiàn)表5-8。

表5-6 幾種免疫金探針離心時(shí)所用轉(zhuǎn)速參考表

膠體金顆粒直徑(nm)蛋白質(zhì)時(shí)間(min)轉(zhuǎn)速(r)
3.0GAR IgG6030000
5.0GAR IgG5025000
10.0RAM IgG5019000
15.0SPA4017000
15.0ALcc IgG4017000
20.0SPA4013000
25.0SPA3512000

說(shuō)明:GAR IgG=羊抗IgG;RAm IgG=兔抗鼠IgG;ALcc IgG=抗肝細(xì)胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白

表5-7 幾種免疫金探針離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速

膠體金顆粒(nm)pH蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)速(xg)時(shí)間(min)
59.0羊抗人IgG4500045
108.2胃癌單克隆抗體4500030
156.5鏈霉親和素1200045
206.0SPA1200030

將純化好的膠體金用0.02mol/l TBS緩沖液作1:20稀釋,用520nm測(cè)OD值。

表5-8 不同大小膠體金的OD值

膠體金顆粒大。╪m)OD(520)nm
52.5
102.5
153.5
205.0

(二)凝膠過(guò)濾法

為純化免疫金探針的最好方法,其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便,過(guò)濾的膠體金顆粒比較均勻,不容易凝集,而離心方法轉(zhuǎn)速高,時(shí)間長(zhǎng),膠體金顆粒沉淀容易凝集,用凝膠過(guò)濾克服了這一弱點(diǎn)。選用本方法時(shí)膠體金溶液必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。具體操作過(guò)程如下:

(1)將濃縮好的膠體金以1500r/min離心去掉大的聚合物。吸出上清待過(guò)柱。

(2)柱高34cm,直徑1cm,加樣體積為柱床體積的1/10。

(3)丙烯葡聚糖S-400(Sephacryls—400, Pharmacia, Sweden)裝柱后用0.02mol/lpH8.2TBS平衡層析柱(pH7.4者用于標(biāo)記的SPA),平衡好后,吸取上清膠體金液體加入層析柱內(nèi),加樣時(shí)請(qǐng)注意不要破壞S—400的界面。

(4)用0.02mol/lpH8.2 TBS洗脫,先行濾出的液體有少量微黃不透亮的液體,緊接著是濃度高紅色而透亮的膠體金,注意顏色的變化,如紅色變淡,變黃立刻停止收集。如Sephacryls—400沒(méi)有,也可以用Sepharose –4B或6B代替(Pharmacia,Sweden)也能收到較好的效果。

六、免疫金探針的鑒定

(1)用有Formvar 膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液,空氣中干燥后醋酸鈾復(fù)染,在TEM下觀察,可見(jiàn)金顆粒周圍有一明顯的空暈,表示顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)分子。

(2)純化后免疫金探針是否保持很好的生物學(xué)活性是判斷其質(zhì)量好壞的主要指標(biāo),因此,在使用之前必須對(duì)它的特異性,敏感性進(jìn)行鑒定。鑒定舉例,用陽(yáng)性抗原片,脫蠟至水,胰蛋白酶消化,加第一抗體(多克隆或單克隆),一般過(guò)夜再加標(biāo)記抗同一抗特異性抗體結(jié)合的膠體金溶液(多克隆或單克隆抗體標(biāo)記的膠體金)詳細(xì)方法步驟見(jiàn)后IgGS法,一般做1:2,1:4,1:8,1:16,稀釋SPA-金,做1:10,1:20,1:40,1:80稀釋,37℃45min,沖洗,顯色,觀察結(jié)果,染色效價(jià)以陽(yáng)性結(jié)果明確,背景淺的稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色試驗(yàn)可以較全面地反應(yīng)免疫金探針的質(zhì)量。

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