實用免疫細胞與核酸:第四節(jié)　免疫活性細胞及其腫瘤的免疫細胞學(xué)

免疫活性細胞組成人體免疫系統(tǒng)組織、器官，是維持人體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定，消除體內(nèi)外抗原性物質(zhì)之危害，起著免疫監(jiān)視作用，是當代重視和研究地十分深入的領(lǐng)域。免疫活性細胞主要包括淋巴細胞、單核/巨噬細胞及網(wǎng)狀細胞等。它們產(chǎn)生的腫瘤—惡性淋巴瘤，是預(yù)后差的一類腫瘤，其形態(tài)與分型十分復(fù)雜。由于淋巴網(wǎng)狀組織學(xué)及功能的特殊性等因各種抗原性刺激而引起的淋巴網(wǎng)狀組織反應(yīng)性增生（Reactive Hyperplasia, RH)、改變復(fù)雜，其與惡性淋巴瘤在組織學(xué)方面鑒別很困難，誤診率可達10%～30%，是臨床病理診斷中的難題。由于免疫細胞化學(xué)，分子生物學(xué)的發(fā)展，已有可能利用單克隆抗體（McAb)或多克隆抗體（PcAb)和IgH,TCR（T細胞受體)基因重排檢測技術(shù)，將免疫活性細胞及其腫瘤細胞的細胞系及分化期、亞型、淋巴瘤良、惡性進行鑒別診斷。免疫細胞化學(xué)技術(shù)簡單易行，具有一定的特異性。且可在組織原位標記。并可用于印片或細胞懸液，配合流式細胞儀，提供更為精細的信息。目前市場供應(yīng)的McAb 與PcAb可已有百種。國際統(tǒng)一稱之為CD系列。已往還有OKT系列和Leu系列。但仍有不足的一面，所有抗體在特異性，表達率均有不足。而且在良、惡性的鑒別作用更是有限。

一、免疫活性細胞的免疫細胞化學(xué)

（一)B淋巴細胞

B淋巴細胞從骨髓干細胞到分化成熟稱為非抗原依賴期。成熟B小淋巴細胞受到抗原刺激后可產(chǎn)生增殖衍化，演變成漿細胞合成分泌Ig。B淋巴細胞存在細胞表面Ig(SIg)及細胞內(nèi)Ig(CIg)。人們利用SIg 與CIg作為抗原制成許多標記抗體。SIg標記只存在于次成熟的轉(zhuǎn)化淋巴細胞。且多數(shù)為IgM·G，而幼稚的前B淋巴細胞與漿細胞缺乏SIg標記。目前較常用的SIg標記McAb有CD₁₉，CD₂₀，CD₂₂，需冰凍切處新鮮組織，而L₂₆則可用于石蠟切片。后又增加LN—1，LN-2，LN-3，MB-1，MB-2及4KB₅等石蠟切片標記抗體。稱它們?yōu)槿獴抗體。

Cig可分Ig重鏈包括IgM、Igg IgA、IgD、IgE5種，輕鏈λ、k兩種，CIg標記抗體表達在愈成熟的B淋巴細胞，幼稚者則陰性。在不同部位組織其表達也不一致。如淋巴結(jié)生發(fā)中心B細胞表達IgD，而腸粘膜淋巴組織中的生發(fā)中心B淋巴細胞則表達IgA。上述IgH、L抗體在一些因素的影響下，真正表達率只有75%左右，而且如巨噬組織、R-S細胞等可以吸收血漿中的Ig而出現(xiàn)假陽性。

表12-2 介紹了淋巴細胞分化各階段的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤，請參閱。

表12-2B淋巴細胞分化各階段細胞的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤

（二)T淋巴細胞

由于T細胞表面存在羊紅細胞受體（E-R)，人們利用T細胞受體作抗原制成多種McAb，如CD₂，T₁₁，OKT₁₁，Leu₅等。發(fā)育不同階段的T細胞ER數(shù)量及親和力不同。未分化T細胞與前T細胞缺乏ER，但它可用TdT抗體標記。T淋巴細胞又分輔助T/誘導(dǎo)（T_H/T₁)志抑制T/毒性T（T_S/T_K)兩大亞型。T_H標記抗體有CD₄等，T_S標記抗體有CD₈。上述幾種抗體要新鮮組織冰凍切片。一般難于廣泛使用。最近制出UCHL-1，MT-1Leu₂₂(L₆₀)等石蠟切片全T性標記抗體，其中UCHL-1已被廣泛采用。新近又推出A₆，MCA₆，比UCHL-1效果要好。OPD₄可用于石蠟切片T_H標記。CD₅，CD₆等McAb特異性不足，可以標記少數(shù)B淋巴細胞，粒細胞等。

表12-3 介紹了T淋巴細胞分布及各階段細胞的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤，請參閱。

表12-3 T淋巴細胞分化各階段細胞的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤

表12-2、12-3引自全國第六屆淋巴瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編，惡性淋巴溜和白血病的免疫組織化學(xué)（綜述)上海腫瘤醫(yī)院，朱雄增。

（三)NK細胞/K細胞

目前認為NK細胞是一種自然殺傷細胞，它殺傷特異性細胞，事先無需致敏，亦無MHC限制的淋巴細胞。K細胞是指能介導(dǎo)ADCC（抗體依賴性毒性淋巴細胞)。過去曾認為NK細胞是胞漿中含有粗大溶酶體的顆粒性大細胞�，F(xiàn)已證明它在分化成熟后才有這一特征。它的表面有高親和力的IL-2受體，在IL-2刺激下可以增殖和表達細胞毒性�；钚院蟮腘K細胞還可表達HLA-DR抗原。NK細胞的標記特點是CD₅₆，CD₂ER，Igg FcR/C₃R均陽性表達，而CD₃，CD₇，CD₁₉陰性表達。后發(fā)現(xiàn)CD₅₇，CD₅₆也是較特異性McAb。對K細胞與NK細胞之間的關(guān)系尚有不同意見，但多數(shù)認為二者www.med126.com系由同一細胞介導(dǎo)。

（四)單核/巨噬細胞與網(wǎng)狀細胞

單核/巨噬細胞不僅參與抗原的提呈和免疫調(diào)節(jié)　，而且是具有特異和非特異吞噬異物功能的免疫活性細胞。單核細胞起源于骨髓干細胞，進入血流，當它到達組織則稱組織細胞。在出現(xiàn)吞噬時則稱巨噬細胞。它分布于不同組織，如枯否氏細胞，肺泡巨噬細胞，腹腔巨噬細胞，腦小膠質(zhì)細胞，甚至破骨細胞等，這類細胞統(tǒng)稱為單核/巨噬細胞系統(tǒng)。不同組織的巨噬細胞其生物學(xué)特性亦有差異。應(yīng)用的標記抗體有抗溶菌酶（lys)，抗α₁-胰蛋白酶（AAT)，抗α₁-糜蛋白酶（ACT)抗體均可用于石蠟切片標記。其中l(wèi)ys抗體反應(yīng)較弱，敏感度不足。新近又推出Mac387,KP1標記抗體、效果十分滿意。另外還有CD₁₁₆，CD₆₄，CD₃₂等FCR抗體，需冰凍切片。

網(wǎng)狀細胞，過去認為它是組織細胞同類細胞。但已證明它是固定于淋巴網(wǎng)狀組織的一類無吞噬功能，但可傳遞抗原信息、調(diào)節(jié)　免疫功能。其細胞發(fā)生尚有爭議。其中包括生發(fā)中心樹突網(wǎng)狀細胞（DRC)，指突狀網(wǎng)狀細胞（IRC)，在髓質(zhì)淋巴竇附近的纖維母細胞網(wǎng)狀細胞以及主要分布在皮膚表皮的朗格罕氏細胞（Langerhan’s cell)等。這類細胞均有類似巨噬細胞的HLA-DR抗原表達，但較弱。它們可對S—100蛋白陽性表達，是與巨噬細胞不同之點。

二、惡性淋巴瘤的免疫細胞化學(xué)標記

惡性淋巴瘤總的可分為非何杰金淋巴瘤（NHL)與何杰金氏病兩大部分。NHL的免疫功能分類繁多�？傮w上各類型的瘤細胞的免疫細胞化學(xué)標記與相應(yīng)的正常細胞標記相一致。但是由于瘤細胞的基因有變異，分化不正常，其抗原性也發(fā)生變化。因此瘤細胞比相應(yīng)正常細胞的表達要弱或喪失。在此不分型描述，而從應(yīng)用角度分為下列三方面進行討論：

（一)惡性淋巴瘤與淋巴網(wǎng)狀組織反應(yīng)性增生的鑒別診斷

組織學(xué)鑒別，在早期濾泡內(nèi)型濾泡型淋巴瘤與淋巴濾泡瘤樣增生、高分化的NHL與RH及假陽性淋巴瘤鑒別方面存在相當?shù)睦щy。必需借于其他有效技術(shù)方法。但免疫細胞化學(xué)標記有一定限制性。其中B淋巴瘤與RH鑒別中可以應(yīng)用IgH和或Igl 標記，及有75%左右的惡性淋巴瘤為IgH和/或IgL單項陽性，即為單克隆性增生，相反如為2項以上陽性為多克隆性RH，但有時少數(shù)淋巴瘤可出現(xiàn)雙克隆性，這方面應(yīng)嚴格排除其他因素引起的假陽性和假陰性，故仍需緊密結(jié)合組織學(xué)改變。T淋巴瘤則缺乏單克隆性標記抗體，在應(yīng)用全T性抗體標記出現(xiàn)單一性或高度優(yōu)勢標記，再結(jié)合組織學(xué)改變可以輔助識別良、惡性。新近報告富于T細胞的B淋巴瘤或富于B細胞的T淋巴瘤（在瘤細胞間伴有大量反應(yīng)性成熟T或B淋巴細胞)，這與良性反應(yīng)性增生更為困難。若瘤細胞體積增大，出現(xiàn)T或B單一性標記，而反應(yīng)性淋巴細胞呈現(xiàn)T、B及組織細胞混雜標記，則有助于良惡性炎鑒別，另外可加用PCNA（增殖細胞核抗原)或Ki—67標記，則瘤細胞一般為陽性。

（二)惡性淋巴瘤與非淋巴瘤網(wǎng)狀組織腫瘤的鑒別

目前有較多的報告淋巴結(jié)外組織未分小細胞癌或網(wǎng)瘤，常規(guī)切片很難與惡性淋巴瘤區(qū)別，小細胞肉瘤有胚胎性橫紋肌肉瘤、外周性神經(jīng)母細胞瘤，Ewing’s肉瘤，Merkel細胞癌以及無色素性惡性黑色素瘤。應(yīng)用免疫組化有較好的鑒別作用。首先應(yīng)根據(jù)HE組織學(xué)改變，一般特殊組織化學(xué)染色初步確定某一類腫瘤的可能。再從總體上先作LCA（白細胞共同抗原)與EMA（上皮膜抗原)免疫細胞化學(xué)標記。確定是淋巴瘤還是未分瘤。如果兩者均陰性則應(yīng)加作其他淋巴瘤抗體標記。因為LCA抗體在漿細胞瘤，T淋巴母細胞淋巴瘤及何杰金氏病R—R細胞不表達。上述標記全陰性，則應(yīng)作Vimentin標記，如為陽性，則為間葉組織源。再用肌球蛋白標記陽性為胚胎性橫紋肌肉瘤。作糖元染色陽性為Ewing肉瘤，NSE陽性為Merkel細胞或肺小細胞癌，S—100陽性為神經(jīng)母細胞瘤。

（三)惡性淋巴瘤的免疫細胞分型

淋巴瘤分型對病人預(yù)后的估計，臨床治療有指導(dǎo)性意義。但這不如良惡性鑒別重要。在日常外檢中進行淋巴瘤分型，應(yīng)挑選針對性強、特異性高、使用方便的標記抗體。如有條件的單位以新鮮組織冰凍切片標記、陽性率高。一般單位病理科則選用石蠟切片標記抗體。目前比較常用而效果穩(wěn)定的石蠟切片標記抗體有L₂₆（全B，除漿細胞瘤)UCL1（全T )KP1或Mac387組織細胞標記。T淋巴瘤應(yīng)用CD₄與CD₈標記區(qū)別輔助T或抑制T。

以上為NHL標記分型。關(guān)于HD的R-S細胞標記。R—s 細胞的發(fā)生組織細胞至今尚未完全肯定、R—S細胞標記抗體最先應(yīng)用LeuM₁(CD₁₅)抗體，它對HD—LPL—H型R—S細胞不標記。且對粒細胞、T細胞、單核/巨噬細胞，甚至上皮細胞也陽性。最近由體外培養(yǎng)的R—S細胞提取抗原制成的Ki-1McAb、對所有類型的R—S細胞均為陽性表達。但對活化的T或B淋巴細胞亦陽性。且需作冰凍切片染色。而可在石蠟切片表達的Ber—H₂抗體問世，就解決了困難問題。

（四)在惡性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事項

為了正確應(yīng)用免疫細胞化學(xué)標記手段在惡性淋巴瘤診斷，分型等方面發(fā)揮更大的作用應(yīng)注意下列問題：①免疫細胞化學(xué)在惡性淋巴瘤分析中應(yīng)緊密結(jié)合組織學(xué)改變，有目的地選用高效、廣譜的抗體，淋巴瘤常用標記抗體見表12-4。因為免疫細胞化學(xué)的結(jié)果受到多種因素的影響，可以出現(xiàn)假陽性或假陰性；②為了避免因抗體標記的局限性而造成漏診，有條件的單位最好一次用同功能的幾種抗體，這樣可以起來抗體間的反應(yīng)互補性，往往比單項抗體f1411.cn/wszg/的標記率高；③標本固定要及時，應(yīng)用中性福爾馬林液或B₅固定液，則抗原保存要好一些。盡可能應(yīng)用低壓，低溫（60^℃以下)浸蠟，減少抗原的破壞丟失；④抗體的濃度要適當，消除背景染色。加用二甲砷酸鈉可除去背景著色。特別膜標記陽性時與背景著色很難區(qū)分。前者包繞細胞呈環(huán)狀；⑤每次染色應(yīng)有陽性對照和陰性對照；⑥目前淋巴瘤的基因重排檢測技術(shù)已經(jīng)建立。特別是多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)擴增技術(shù)的應(yīng)用，提供了特異（無假陽性)，敏感（可檢測出1/100萬瘤細胞)快速（當天可出報告)的淋巴瘤檢測手段。作者科室已建立了該項技術(shù)。雖然其設(shè)備條件要求比較高�？勺鳛橐呻y、早期、化療后殘留病灶病例的確診。

表12-4 淋巴瘤常用標記抗體

※可用石蠟切片標記的McAb