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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié) 分子克隆載體

載體(vector)是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子,在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子,即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。因此,作為載體應(yīng)該滿足以下幾方面f1411.cn/wszg/的要求:①有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn),…

載體(vector)是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子,在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子,即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。因此,作為載體應(yīng)該滿足以下幾方面f1411.cn/wszg/的要求:①有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn),最好是有許多種限制酶的切點(diǎn),而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè);②外源DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制,載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無害,以及載體能接納盡可能大的外源DNA片段;③有利于選擇的標(biāo)記基因,可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入,以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出;④具有促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。

重組DNA技術(shù)中最常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體λ,柯斯質(zhì)粒(cosmid)和噬菌體M13。它們的受體細(xì)胞都是大腸桿菌。這四種載體的大小和結(jié)構(gòu)盡管各不相同,但它們的共同特點(diǎn)是:①都能在大腸桿菌中自主復(fù)制,而且f1411.cn/hushi/能連同所帶的外源DNA一起復(fù)制;②都很容易同細(xì)菌DNA分開并加以純化;③都有一段DNA對(duì)于它們自身在細(xì)菌中的增殖不是必需的。因此,外源DNA可以插入這一段DNA中,或是置換這一段DNA而不影響載體的復(fù)制。根據(jù)這一特點(diǎn),載體又可分成插入型和置換型兩大類。

一、質(zhì)粒

質(zhì)粒(plasmid)是許多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的染色體外的遺傳因子,它是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子,大小從1kb直到200kb以上。質(zhì)粒所帶的基因通常有利于宿主細(xì)胞。例如基因的產(chǎn)物是某些抗生素或?qū)δ承┛股氐目剐、能降解某些?fù)雜的有機(jī)化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素、產(chǎn)生限制酶或修飾酶等。

在天然條件下,許多種質(zhì)粒是通過類似于細(xì)菌接合的過程傳遞給新的宿主。在實(shí)驗(yàn)室條件下,質(zhì)粒則可通過轉(zhuǎn)化過程進(jìn)入受體細(xì)胞。此時(shí),受體細(xì)胞已經(jīng)過處理而處于感受態(tài),即它的細(xì)胞暫時(shí)易于讓小的DNA分子透過。受體細(xì)胞由于質(zhì)粒的進(jìn)入而產(chǎn)生了新的表型。如對(duì)某種抗生素的抗性,這樣就可用這種抗生素作為選擇條件,選出被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。

質(zhì)粒復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身染色體的同一組酶系。有些質(zhì)粒處于“嚴(yán)緊控制”之下,即它們的復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的。因此在每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝,或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒。另一些質(zhì)粒則是處于“松弛控制”之下的“松弛型”質(zhì)粒。每個(gè)細(xì)菌中可以有10~200份拷貝。更重要的是松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù),可因宿主細(xì)胞停止合成蛋白質(zhì)而增加至幾千份。宿主細(xì)胞不合成蛋白質(zhì)時(shí),染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制都中止。但松弛型質(zhì)粒仍繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制。因此在增殖松弛型質(zhì)粒時(shí),總是要讓宿主菌經(jīng)氯霉素處理(在培養(yǎng)液中加入適量的氯霉素)抑制蛋白質(zhì)的合成。

圖23-3 pBR322的基本結(jié)構(gòu)

(一)大腸桿菌質(zhì)粒

應(yīng)用的最廣泛的質(zhì)粒載體是pBR322,它屬松弛型質(zhì)粒,有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個(gè)抗性基因可作為標(biāo)記基因,有許多種常用的限制酶的切點(diǎn)。它全長4352個(gè)核苷酸,排列順序已全部測(cè)定,基本結(jié)構(gòu)如圖23-3。

當(dāng)需要用pBR322來克隆BamHI酶切的一個(gè)DNA片段時(shí),一般的做法是如圖23-4所示。

圖23-4 pBR322克隆DNA片段的程序

從圖23-4可見,外源DNA片段同pBR322都經(jīng)Bam HⅠ酶切,所以有相同的單鏈“粘性末端”,通過DNA連接酶可以構(gòu)成重組DNA分子。由于pBR322的BamHⅠ酶切點(diǎn)在四環(huán)素的抗性基因中,所以Bam HⅠ酶切后使這個(gè)抗性基因失活。如果酶切后的質(zhì)粒pBR322自身又重新連接,則恢復(fù)對(duì)四環(huán)素的抗性,轉(zhuǎn)化子就仍然具有對(duì)二種抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA,則轉(zhuǎn)化子失去了四環(huán)素抗性表型,而只有對(duì)氨芐青霉素的抗性,這樣就可根據(jù)轉(zhuǎn)化子的抗性而把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌選出,然后擴(kuò)增細(xì)菌,大量回收質(zhì)粒DNA,從而達(dá)到大量擴(kuò)增外源DNA的目的。

(二)真核生物中的質(zhì)粒

真核生物中的酵母是國內(nèi)外廣泛研究的載體-受體系統(tǒng)之一。這是一個(gè)共價(jià)閉環(huán)DNA分子(cccDNA),平均周長2μm,所以稱為2μm DNA質(zhì)粒,在每個(gè)酵母細(xì)胞里約有100個(gè)拷貝。已有人把2μm DNA同pBR322 DNA構(gòu)建成雙功能質(zhì)粒,可在大腸桿菌和酵母菌中復(fù)制。這種質(zhì)粒帶有啤酒酵母的二個(gè)基因(his 3和Leu 2),所以很容易用酵母的營養(yǎng)缺陷型菌株來選出。

二、噬菌體和病毒載體

噬菌體λ是最主要的一種載體。自從1974年以來,已用野生型λ改造和構(gòu)建出一系列噬菌體載體。

噬菌體λ是溫和噬菌體。基因組是長約50kb的雙鏈DNA分子。在噬菌體λ顆粒中,DNA是線狀雙鏈分子帶有單鏈的互補(bǔ)末端。末端長12個(gè)核苷酸,這稱為粘性末端,簡寫COS。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后,雙鏈DNA分子通過COS而成環(huán)狀。在感染早期,環(huán)狀DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在此期間,噬菌體有兩條復(fù)制途徑可供選擇:一是裂解生長。環(huán)狀DNA分子在宿主細(xì)胞里復(fù)制若干次,合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物,形成子代噬菌體顆粒,成熟后使細(xì)菌裂解,釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長。噬菌體DNA整合進(jìn)宿主菌的基因組,然后象細(xì)菌染色體上的基因一樣進(jìn)行復(fù)制,并傳遞給下一代細(xì)菌。

(一)噬菌體λ載體的構(gòu)建

野生型噬菌體λDNA全長約50kb,上有65種限制酶酶切點(diǎn),除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個(gè)切點(diǎn)外,其余都多于2個(gè)。有些酶切點(diǎn)在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此,噬菌體λ必須經(jīng)過改造才能用作載體,F(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點(diǎn)。因此,作為載體的噬菌體λ都短于野生型。

噬菌體λ載體有兩種類型:①插入型。由于改建后的噬菌體λDNA都短于野生型,所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長,插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個(gè)區(qū)域,左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個(gè)成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因,全長約20kb。右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因,這個(gè)區(qū)域約長12kb。中間區(qū)域約長18kb,這一段DNA可以被外源置換而不會(huì)影響噬菌體λ裂解生長的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。

噬菌體λ裂解生長的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關(guān)。當(dāng)DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時(shí),噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39~53kb之間。

置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后,要設(shè)法除去中間片段,只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接,包裝成重組噬噬體。這是因?yàn)樽蟊酆陀冶叟c中間片段間都有單鏈“粘性末端”,在連接酶作用下可以重新恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu),從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復(fù)的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍(lán)色噬菌斑試驗(yàn)。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當(dāng)這種噬菌體感染lac宿主細(xì)胞并在含有Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)的培養(yǎng)基上生長時(shí),半乳糖苷酸與Xgal反應(yīng)的產(chǎn)物為不溶性的靛藍(lán)染料。因此,含有中間片段的重新恢復(fù)的噬菌體形成藍(lán)色噬菌斑;而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無色透明的。

(二)單鏈?zhǔn)删w載體

最常用的單鏈?zhǔn)删w載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體,有長約6500個(gè)核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上,所以它們只能感染雄性細(xì)菌,即F’或Hfr細(xì)菌。當(dāng)噬菌體進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后,單鏈的噬菌體DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從細(xì)胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當(dāng)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞里積聚了200到300份RF型拷貝時(shí),M13開始不對(duì)稱的合成,即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒,顆粒不斷地從感染細(xì)胞上芽生。M13感染雖不殺死細(xì)胞,但細(xì)胞的生長受到一定的抑制,所以形成混濁的噬菌斑。

M13的基因組中除有一段507個(gè)核苷酸,其余都含有與其復(fù)制有關(guān)的遺傳信息。因此,只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點(diǎn)是從細(xì)菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA,其中包含了克隆DNA片段的二條互補(bǔ)鏈中的一條,因此可用來作為對(duì)DNA測(cè)序的模板。另外,可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補(bǔ)的RNA。M13的RF型是雙鏈DNA,便于限制酶的識(shí)別和切割,克隆進(jìn)雙鏈的外源DNA。從細(xì)菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA。問題是插入M13的外源DNA超1000bp時(shí)就不穩(wěn)定,在噬菌體增殖時(shí)會(huì)出現(xiàn)缺失。一般說,插入300~400bp是相當(dāng)穩(wěn)定的。

(三)猴病毒40(SV40)

猴病毒40(SV40)的基因組常用來作為克隆載體,把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。猴病毒40是球形動(dòng)物病毒,直徑40nm,呈20面體,有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA基因組,全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因(包括所有的間插順序和兩側(cè)順序)整合在SV40中后,在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。

可是,SV40作為克隆載體有其局限性:①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性,不利于外源DNA的重組和表達(dá);②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān),使用時(shí)有顧慮;③重組DNA片段的大小受體限制。

(四)逆轉(zhuǎn)錄病毒

逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒,它有三個(gè)基因:gag-編碼病毒的核心蛋白;pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶;env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因(vonc),即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來,已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒(defective virus)使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體,成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞,并在細(xì)胞中表達(dá)。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒,因此不能合成自身的外殼,但它有識(shí)別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號(hào)(一段尚未鑒定的DNA順序)。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株,這種細(xì)胞株包含有輔助病毒(helpervirus)。輔助病毒能合成蛋白外殼,但缺失了識(shí)別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號(hào),因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后,逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白,成為病毒顆粒。這時(shí)把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng),包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA,進(jìn)入骨髓細(xì)胞,病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組,基因的活性得到表達(dá)。這時(shí),由于骨髓細(xì)胞里面沒有輔助病毒,所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒,不再有外殼蛋白可供包裝,因此也就無法增殖,而只能被“陷”在宿主基因組中,通過細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。

三、柯斯質(zhì)粒

1978年Collins和Hohn構(gòu)建一種新型的大腸桿菌克隆載體,命名為cosmid(柯斯質(zhì)粒)。它是用正常的質(zhì)粒同噬菌體λ的cos位點(diǎn)構(gòu)成。例如,柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成(圖23-5),全長43.kb。在包裝時(shí),cos位點(diǎn)打開而產(chǎn)生噬菌體λ的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA,所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性兩個(gè)標(biāo)記。圖23-5說明了克隆基因時(shí)有用的限制酶切點(diǎn)。所以可以說柯斯質(zhì)粒是一類特殊的重組質(zhì)粒。

圖23-5 柯斯質(zhì)粒pHC79

設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長4~6kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長度相當(dāng)于噬菌體基因組,就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此,插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)粒可象噬菌體λ一樣感染大腸桿菌,并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。如把宿主菌在含氯霉素的培養(yǎng)基中生長,柯斯質(zhì)?梢詳U(kuò)增到宿主細(xì)胞DNA總量的50%左右。

采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難是:①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右,因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接,結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理,可阻止載體分子自身連接;②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子,結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段,會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,后來專門選出30~45kb的外源DNA插入載體DNA,此時(shí),每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段,因?yàn)槿绻幤,則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度;③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑,因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫,則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間,F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法,但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定,插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等,所以最常使用的還是噬菌體載體。

現(xiàn)將上面提到的四種載體作一比較(表23-3)

表23-3 四種載體的比較

 質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w
克隆DNA大片段±*++-
構(gòu)建基因組文庫-++-
構(gòu)建cDNA文庫+---
常規(guī)的亞克隆化+---
構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+---
序列分析+--+
單鏈探針+**--+
外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+---

* 外源DNA如超過10kb,則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低

** 已有個(gè)別質(zhì)料可用于此目的

四、其他載體

現(xiàn)在提到的分子載體有的不是用于克隆某基因,而是作為外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。

(一)轉(zhuǎn)座子載體

這里主要提一下有關(guān)果蠅轉(zhuǎn)座因子(P因子)作為基因載體。因?yàn)檫@是很有希望的真核生物基因工程的載體,果蠅的P因子約長3kb,每端各有反向重復(fù)順序,當(dāng)它插入基因組時(shí),可以激活或滅活近旁的基因,當(dāng)它從基因組上切下來時(shí),也可能把近旁的基因或DNA順序一起切下而引起突變。現(xiàn)在已能把帶有某種限制酶切點(diǎn)的P因子克隆到質(zhì)粒pBR322中,然后在P因子酶切點(diǎn)上插入外源DNA。經(jīng)過擴(kuò)增后,將這種重組DNA用微量注射儀直接注入果蠅的受精卵中。結(jié)果所克隆的基因能隨P因子插入受體細(xì)胞的基因里,并且得到表達(dá)。

(二)人工微小染色體

包括人體在內(nèi)的高等生物基因工程中遇到的一個(gè)難題是缺乏合適的基因載體。要求載體對(duì)受體細(xì)胞沒有危害,能安全、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)給后代,使基因的性狀得到連續(xù)的表達(dá)。這對(duì)校正某種遺傳缺陷或改進(jìn)某種性狀都是十分有用的。目前一些實(shí)驗(yàn)室正致力于構(gòu)建人工微小染色體(microchromosome)。

構(gòu)建染色體應(yīng)包括:基因、復(fù)制起點(diǎn)、著絲粒和端粒。染色體上需帶有基因是不言而喻的。復(fù)制起點(diǎn)是染色體復(fù)制所不可缺少的。著絲粒保證復(fù)制后的染色體均等地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。端粒具有某種特定結(jié)構(gòu)以保證染色體的個(gè)體性。

首先,構(gòu)建的是酵母的人工微小染色體。天然的酵母染色體為150~1000kb。人工構(gòu)建的微小染色體長55kb,在細(xì)胞內(nèi)很穩(wěn)定,只是每個(gè)細(xì)胞里的拷貝數(shù)很少。比如已構(gòu)成的人工微小染色體為7~15kb,每個(gè)細(xì)胞里的拷貝數(shù)雖然增多,但不夠穩(wěn)定。

人工構(gòu)建酵母微小染色體的具體步驟見圖23-6。從圖中可以看到,先用質(zhì)粒pBR322為材料,連接酵母的標(biāo)記基因Leu2(亮氨酸)后去轉(zhuǎn)化大腸桿菌,然后再接上酵母染色體上分離得到的著絲粒CEN3,再去轉(zhuǎn)化大腸桿菌以增殖重組質(zhì)粒,取得下一步實(shí)驗(yàn)用的DNA。接下去是連接從酵母(真核生物)中分離得到的ARS1。ARS是指自主復(fù)制順序(autonomouslyreplicat-ing sequence),這個(gè)順序中可能包含著復(fù)制起點(diǎn)。目前已從非洲爪蟾的線粒DNA,衣藻和煙草葉綠體和核DNA中分離ARS。最后一個(gè)步驟是接上染色體端粒。用的是四膜蟲(Te-trahymena)的rDNA末端(Tr末端)。這樣構(gòu)建成的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后,在細(xì)胞內(nèi)斷開成為線狀重組DNA分子,可以象天然染色體一樣地復(fù)制和分離,這就是酵母線狀質(zhì)粒YLp4。

圖23-6 構(gòu)建酵母人工微小染色體的步驟

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