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免疫學和免疫學檢驗:第一節(jié) 免疫膠體金的制備

一、膠體金的特性和制備(一)膠體金的結構膠體金(colloidalgold)也稱金溶膠(goldsol),是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核(原子金Au)及包圍在外的雙離子層構成,緊連在金核表面的是內層負離子(AuC12-),外層離子層H+則分散在膠…

一、膠體金的特性和制備

(一)膠體金的結構

膠體金(colloidalgold)也稱金溶膠(goldsol),是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核(原子金Au)及包圍在外的雙離子層構成,緊連在金核表面的是內層負離子(AuC12),外層離子層H+則分散在膠體間溶液中,以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。

膠體金顆粒的基礎金核并非是理想的圓球核,較小的膠體金顆;臼菆A球形的,較大的膠體金顆粒(一般指大于30nm以上的)多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。

(二)膠體金的特性

1.膠體性質膠體金顆粒大小多www.med126.com在1~100nm,微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中,成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性,特別是對電解質的敏感性。電解質能破壞膠體金顆粒的外周永水化層,從而打破膠體的穩(wěn)定狀態(tài),使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒,而從液體中沉淀下來。某些蛋白質等大分子物質有保護膠體金、加強其穩(wěn)定性的作用。

2.呈色性微小顆粒膠體呈紅色,但不同大小的膠體呈色有一定的差別。最小的膠體金(2~5nm)是橙黃色的,中等大小的膠體金(10~20nm)是酒紅色的,較大顆粒的膠體金(30~80nm)則是紫紅色的。根據(jù)這一特點,用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計金顆粒的大小。

3.光吸收性膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰,這個光吸收峰的波長(λmax)在510~550nm范圍內,隨膠體金顆粒大小而變化,大顆粒膠體金的λmax偏向長波長,反之,小顆粒膠體金的λmax則偏于短波長,表19-1所列為部分膠體金的λmax。

(三)膠體金的制備

1.制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸(HauC14)是主要還原材料,常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強弱,可以制備0.8nm~150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下:

(1)將HauC14先配制成0.01%水溶液,取100ml加熱至沸。

(2)攪動下準確加入一定量的1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液。

(3)繼續(xù)加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色,續(xù)而轉成黑色,隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2~3min。

(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積。

用此法可制備16~147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時加入的檸檬酸三鈉的量。表19-1列舉制備4種不同粒徑膠體金時檸檬酸三鈉的用量。

表19-1 四種粒徑膠體金的制備及特性

膠體金粒徑(nm)1%檸檬酸三鈉加入量(ml)*膠體金特性
呈色λmax 
162.00橙色518nm
24.51.50橙紅522nm
411.00紅色525nm
71.50.70紫色535nm

*還原100ml0.01%HauC14所需量

2.注意事項

(1)氯金酸易潮解,應干燥、避光保存。

(2)氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性,因此在配制氯金酸水溶液時,不應使用金屬藥匙稱量氯金酸。

(3)用于制備膠體金的蒸餾水應是雙蒸餾水或三蒸餾水,或者是高質量的去離子水。

(4)是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的,用前應先經酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經硅化處理的,硅化方法可用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘,用蒸餾水沖凈后干燥備用。

(5)膠體金的鑒定和保存:膠體金的制備并不難,但要制好高質量的膠體金卻也并非易事。因此對每次制好的膠體金應加以檢定,主要檢查指標有顆粒大小,粒徑的均一程度及有無凝集顆粒等。

肉眼觀察是最基本也是最簡單和方便的檢定方法,但需要一定的經驗。良好的膠體金應該是清亮透明的,若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物,提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細觀察比較膠體金的顏色,可以粗略估計制得的金顆粒的大小。當然也可用分光光度計掃描λmax來估計金顆粒的粒徑。結制備的膠體金最好作電鏡觀察,并選一些代表性的作顯微攝影,可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。

膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存,加入少許防腐劑(如0.02%NaN3)可有利于保存。保存不當時會有細菌生長或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并不影響以后膠體金的標記,使用時為提高標記效率可先低速離心去除凝集顆粒。

二、免疫金的特性和制備

(一)免疫金的特性

膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合,在免疫組織化學技術中,習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質(抗原或抗體)結合,這類膠體金結合物常稱為免疫金復合物,或簡稱免疫金(immunogold)。

膠體金與蛋白質結合的機制尚有十分清楚,一般認為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷,與蛋白質表面的陽性電荷通過靜電感應相附。因此環(huán)境pH和離子強度是影響吸附的主要因素,其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質的分子量及蛋白質濃度等也會影響蛋白質的吸附。

(二)免疫金的制備

1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1調節(jié)膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選www.med126.com擇待標記蛋白質等電點,也可略為偏堿。但通常最適反應pH往往需經多次試驗才能確定。

在調節(jié)膠體金的pH值時應注意,膠體金會阻塞pH計的電極,不可直接將電極插入膠體金溶液中,宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇(PEG,20000)穩(wěn)定膠體金后,再膠體金的pH值。

2.將1/10體積的合適濃度的蛋白質溶液加于膠體金溶液中,放置室溫反應2~5min。

由于鹽類成分能影響膠體金對蛋白質的吸附,并可使膠體金聚沉,因此待標記蛋白質溶液若含有較高的離子濃度,應在標記前先對低離子強度的蒸餾水透析去鹽。

3.加入濃度為0.2%的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。

4.離心分離,去除上清液中未結合的蛋白質。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異:對5nm金顆?蛇x用40000r/min離心1h;8nm金顆粒用25000r/min離心45min;14nm金顆粒用25000r/min離心30min,40nm金顆粒用15000r/min離心30min。

5.輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮,恢復原體積后再離心。如此洗滌2~4次。以徹底除去未結合的蛋白質。

6.免疫金復合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。

多種蛋白質、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑,PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用:一為保護膠體金的穩(wěn)定性,使之便于長期保存;二為防止或減少免疫金復合物的非特異性吸附反應。穩(wěn)定劑的合理選擇是十分重要的,不適當?shù)姆(wěn)定劑有時也會導致非特異性反應。

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