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人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品

公開(公告)號 CN101037477A  
公開(公告)日 2007.09.19  
申請(專利)號 CN200710020034.7  
申請日期 2007.02.08  
專利名稱 人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品  
主分類號 C07K19/00(2006.01)I  
分類號 C07K19/00(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 江南大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計)人 金 堅;張蓮芬;徐 鈺;許正宏;雷楗勇;竇文芳;史仲平  
地址 214122江蘇省無錫市蠡湖大道1800號  
頒證日  
國際申請  
進入國家日期  
專利代理機構(gòu) 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所  
代理人 時旭丹;劉品超  
國省代碼 江蘇;32  
主權(quán)項 人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法,其特征是從新鮮人外周血中分離單核淋巴細(xì)胞,刺激培養(yǎng),提取RNA,通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到G-CSFcDNA;通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSAcDNA;利用重疊PCR技術(shù),連接HSAcDNA和G-CSFcDNA,中間不加入任何連接肽,得到的HSA-GCSFcDNA融合基因插入到克隆載體,HSA-GCSFcDNA融合基因在宿主系統(tǒng)進行表達(dá),HSA-GCSFcDNA融合基因被整合到宿主的染色體中; (1)G-CSFcDNA的克。 以反轉(zhuǎn)錄PCR得到的G-CSFcDNA第一鏈為模板,通過PCR擴增出G-CSFcDNA,所用的引物如下: p1:5’-CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2:5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,G-CSFcDNA第一鏈1μg,加雙蒸水補齊50μl,PCR條件為:95℃變性10分鐘,94℃變性1分鐘,66.5℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,循環(huán)35次; 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標(biāo)片段,純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切;瓊脂糖凝膠電泳純化,用PCR片段膠回收試劑盒回收,用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過夜;挑取白色菌落,接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒;通過PCR,及EcoRI和NotI雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆,并對重組質(zhì)粒EcoRI和NotI雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序;陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中,凍于-80℃;重組質(zhì)粒命名為pBlue-GCSF,陽性重組子命名為DH5α/pBlue-GCSF; (2)HSAcDNA的克。 利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSAcDNA,所用的引物為: PH1:5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2:5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer1μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,人胎肝cDNA文庫1μg,加雙蒸水補齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,94℃變性1分鐘,60℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,循環(huán)30次; 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶,用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段,純化好的目標(biāo)片段和載體pBlue分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切;瓊脂糖凝膠電泳純化,用PCR片段膠回收試劑盒回收,用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過夜;挑取白色菌落,接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒;通過PCR,及SalI和HindIII雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆,并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進行DNA測序;陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中,凍于-80℃;重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA,陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA; (3)HSAcDNA和G-CSFcDNA融合基因的克。 HSAcDNA的PCR擴增,所用引物如下: P1:5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2:5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,pBlue-HSA1μg,加雙蒸水補齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,65℃退火1分鐘,72℃延伸4分鐘,94℃變性1分鐘,循環(huán)30次; G-CSFcDNA的PCR擴增,所用引物如下: P3:5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4:5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下:50μl的反應(yīng)體系中加入:10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl,2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,pBlue-GCSF1μg,加雙蒸水補齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,66.5℃退火1分鐘,72℃延伸90秒,94℃變性1分鐘,循環(huán)30次; 利用重疊PCR融合G-CSFcDNA和HSAcDNA: 將G-CSF的PCR擴增產(chǎn)物和HSA的PCR擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍,再以4∶6比例混合后作為模板,于50μl的反應(yīng)體系中加入:2mmol/L的dNTP5μl,10×pfuBuffer5μl,5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl,混合好的模板1μl,加雙蒸水補齊50μl;PCR條件為:95℃變性5分鐘,60.5℃退火1分鐘,72℃延伸4分鐘,94℃變性1分鐘,循環(huán)30次; 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物,在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶  
摘要 人血清白蛋白與人粒細(xì)胞集落刺激因子的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品,屬于長效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù),將HSA基因cDNA和G-CSF cDNA進行拼接,中間不加入任何連接肽,得到的HSA-GCSF cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進行表達(dá),融合基因被整合到宿主的染色體中;本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85%序列同源的第一區(qū)和與人粒細(xì)胞集落刺激因子至少85%序列同源的第二區(qū),該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯拢M行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入;宿主系統(tǒng)可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞等。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人粒細(xì)胞集落刺激因子的生理特性的基礎(chǔ)上延長其在體內(nèi)的半衰期,在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。  
國際公布  
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