| 公開(公告)號(hào) | CN1706953A |
| 公開(公告)日 | 2005.12.14 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410055553.3 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.08.04 |
| 專利名稱 | 重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因的克隆、工程菌的構(gòu)建與鑒定以及工業(yè)化生產(chǎn)的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/57 |
| 分類號(hào) | C12N15/57;C12N15/11;C12N9/48;A61K38/49;A61P7/02 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | 2004.6.4 CN 200410044921.4 |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 南京大學(xué)生物制藥工程研究中心 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 劉建寧;陳于紅;張 菁;孫自勇;朱鎮(zhèn)華;張 巍 |
| 地址 | 210093江蘇省南京市漢口路22號(hào)南京大學(xué)蒙民偉樓22層 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 夏 平 |
| 國(guó)省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因的克隆、工程菌的構(gòu)建與鑒定以及工業(yè)化生產(chǎn)的方法，其特征在于：a.從人臍帶靜脈上皮細(xì)胞中克隆人組織型纖溶酶原激活劑基因，將其接入TA克隆載體PCR2.1中，以該重組質(zhì)粒DNA為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得了重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因(K2tPA)；b.將上述重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因(K2tPA)與表達(dá)質(zhì)粒pET29a通過基因重組的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET29a/K2tPA，將重組后的表達(dá)質(zhì)粒pET29a/K2tPA轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，構(gòu)建成表達(dá)重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體蛋白(K2tPA)的工程菌；c.將上述表達(dá)重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體基因(K2tPA)的工程菌每隔3個(gè)月取出生產(chǎn)種子一支，進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性及表達(dá)穩(wěn)定性鑒定；d.將重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體(K2tPA)工程菌經(jīng)種子罐培養(yǎng)及發(fā)酵罐工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，其表達(dá)量用占菌體總蛋白的百分含量來表達(dá)。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域中應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的范疇。本發(fā)明公開了一種新的具有快速溶栓效果的人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體蛋白K2tPA的制備方法和應(yīng)用。其制備方法是用基因工程技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)K2tPA的重組質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)。將含有人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體(K2tPA)重組表達(dá)質(zhì)粒的工程菌經(jīng)10L種子罐培養(yǎng)及100L發(fā)酵，每100L發(fā)酵液得重組人組織型纖溶酶原激活劑缺失變體(K2tPA)純品4g，純度達(dá)95％以上，比活大于50萬IU/mg，內(nèi)毒素及熱源含量、宿主蛋白殘留量、宿主DNA殘留量等均達(dá)到臨床使用標(biāo)準(zhǔn)，可用于心、腦血管疾病的血栓形成的治療。 |
| 國(guó)際公布 |
