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1 材料和方法
1.1 材料
wistar大鼠(武漢大學實驗動物中心提供)，雌雄不拘，體質(zhì)量150 g左右。實驗試劑:胰蛋白酶(Gibco),谷氨酰胺(武漢天源生物技術(shù)有限公司)，胎牛血清(Gibco),DMEM干粉培養(yǎng)基(Hyclone)。
1.2 鼠尾膠原的制作實驗所用膠原溶液為酸溶性鼠尾腱膠原。將wistar大鼠的尾部剪下，浸入75%的乙醇中消毒30 min，在無菌條件下將鼠尾腱抽出剪碎，置于5 g/L乙酸中，4 ℃條件下持續(xù)攪拌，48 h后低溫離心去渣(10 000 r/min,30 min)，收集上清液。
1.3 BMSC培養(yǎng)按文獻[1]取材。4~5周齡肝素化wistar大鼠斷頸處死,無菌條件下分離雙側(cè)股骨和脛骨，在含2%胎牛血清完全培養(yǎng)基的玻璃平皿中，去除股骨周圍組織，剪去包括骺板在內(nèi)的兩側(cè)骺端，抽取5 mL含2%胎牛血清的完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，離心獲得骨髓細胞團，再用15%胎牛血清完全培養(yǎng)基將細胞團重懸為單細胞懸液，接種于玻璃培養(yǎng)瓶中(37 ℃，5%CO2，飽和濕度)培養(yǎng)，于24 h后半量換液。此后每隔2~3 d換液一次，以棄去未貼壁細胞。細胞長至70%~80%融合時傳代。
1.4 BMSC膠原網(wǎng)架制作取第二代對數(shù)生長期細胞胰酶消化后，用胎牛血清制成單細胞懸液，細胞含量為2×108/L。細胞懸液∶10×DMEM∶膠原溶液按1∶12∶120的容積比例，置冰上充分混勻，用1 mol/L的氫氧化鈉中和至PH值為中性。取100 μL加入一個24孔板中(板底鋪多聚賴氨酸包被過的玻片)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中放置10 min，待培養(yǎng)板中形成半固體凝膠后，加入1 mL完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)，2~3 d換液一次。培養(yǎng)15 d共聚焦顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)特點。
1.5 MTT法繪制細胞生長曲線按上述方法制備BMSC膠原混懸液，將混懸液滴于24孔板中，每孔0.2 mL，置于培養(yǎng)箱中10 min以形成半固體凝膠。加入1 mL完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3 d換液1次。從培養(yǎng)第2天起，每次取3孔，用5 g/L膠原酶消化，制備單細胞懸液。將單細胞懸液加入180 μL新鮮DMEM完全培養(yǎng)基和20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄去培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)80 r/min振搖10 min，充分溶解，酶標儀上讀取570 nm處的A值，取3孔的平均值作為增殖變化指標。連續(xù)13 d檢測細胞增殖，繪制生長曲線。
1.6 ALP鈣鈷染色、蘇丹Ⅲ染色培養(yǎng)第15天，取出細胞爬片，10%甲醛固定，0.1%Triton破膜，分別行ALP鈣鈷染色(入2%硝酸鈷水溶液及1%硫化銨水溶液染色)、蘇丹Ⅲ染色(入蘇丹Ⅲ染液中孵育)，顯微鏡下隨即選擇15個不重疊視野，統(tǒng)計陽性染色細胞率(陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)×100%)。
2 結(jié)果
2.1 BMSC形態(tài)特征連續(xù)15 d觀察發(fā)現(xiàn)，24 h后細胞已開始伸展呈長梭形，但在前1周內(nèi)，BMSC呈現(xiàn)集落生長趨勢，絕大部分細胞以長梭形為主，隨著時間延長，近似圓形、扁形、三角形細胞逐漸增多，且細胞之間伸出突觸互相連接，交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖1)醫(yī).學.全.在.線f1411.cn。
2.2 BMSC生長特征在15 d內(nèi)，BMSC細胞數(shù)目逐漸增多，細胞體積逐漸增大，整個過程呈現(xiàn)出逐漸生長趨勢，且第4~10天為細胞生長高峰期，到達11 d左右細胞生長基本靜止(見圖2)。
圖2 三維培養(yǎng)中BMSC生長曲線(略)
2.3 BMSC向成骨細胞及脂肪細胞分化能力培養(yǎng)至7 d后，可見細胞形態(tài)逐漸多樣化，其中以圓形或梭形多突起細胞(近似骨細胞形態(tài))為主，該類細胞鈣鈷染色為陽性;細胞形態(tài)相對較大的圓形或橢圓形空泡狀細胞，蘇丹Ⅲ染色為陽性。鈣鈷染色陽性率高于蘇丹Ⅲ染色細胞陽性率(見圖3~4)。
