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運(yùn)行緩沖液的濃度及pH值對(duì)ECL光強(qiáng)的影響： 因運(yùn)行緩沖液的pH值影響分離中的電滲流大小和分析物所帶電荷，從而影響其分離效果。實(shí)驗(yàn)中考察了20mmol/L pH值5.0～9.5范圍內(nèi)磷酸鹽緩沖液對(duì)ECL光強(qiáng)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為7.16時(shí)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，而后ECL光強(qiáng)隨著pH值的增大而減小。固定運(yùn)行緩沖溶液pH值到7.16，考察了磷酸鹽緩沖液濃度在10～50mmol/L范圍內(nèi)變化時(shí)ECL光強(qiáng)的變化，當(dāng)濃度大于30mmol/L時(shí)，ECL光強(qiáng)有所降低，可能是因?yàn)殡x子強(qiáng)度的增加導(dǎo)致焦耳熱效應(yīng)的增加。故在實(shí)驗(yàn)中選擇pH值為7.16的20mmol/L的運(yùn)行緩沖液。
進(jìn)樣高壓和進(jìn)樣時(shí)間對(duì)ECL光強(qiáng)的影響： 儀器采用自動(dòng)電遷移進(jìn)樣，按2.1中公式，對(duì)于特定分析物和毛細(xì)管，電動(dòng)進(jìn)樣體積決定于進(jìn)樣時(shí)間ti，進(jìn)樣電壓Ei和分離電壓Es。其毛細(xì)管柱效按以下公式評(píng)價(jià)[1]：N=5.54(tm/W0.5h)2，N表示理論塔板數(shù)，tm是遷移時(shí)間，W0.5h表示半峰寬。在考察進(jìn)樣時(shí)間對(duì)ECL光強(qiáng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)其在3～19s變化時(shí)，在10s時(shí)ECL光強(qiáng)達(dá)到最大。因此選擇進(jìn)樣時(shí)間為10s。當(dāng)進(jìn)樣高壓在3～19kV范圍內(nèi)變化時(shí)，隨著進(jìn)樣高壓的增加，ECL光強(qiáng)增強(qiáng)但是柱效降低。在進(jìn)樣高壓達(dá)到15kV之后，電泳峰開始變寬，因此選擇進(jìn)樣電壓為15kV。電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是在工作電極表面發(fā)生。因此，ECL光強(qiáng)依賴于工作電極表面擴(kuò)散層分析物的濃度，在高的進(jìn)樣電壓下，較多的分析物進(jìn)入擴(kuò)散層，產(chǎn)生較強(qiáng)的ECL光強(qiáng)。然而，當(dāng)進(jìn)樣量過大時(shí)，分析物的散布導(dǎo)致峰展寬，柱效降低。綜合各因素，將進(jìn)樣時(shí)間和進(jìn)樣電壓確定為10s，15kV。
2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化
2.2.1 檢測(cè)電位對(duì)ECL光強(qiáng)的影響
施加在電極上的電壓引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，從而影響其ECL發(fā)光強(qiáng)度。因此，檢測(cè)電位應(yīng)至少高于發(fā)光試劑的氧化電位，以使其生成Ru(bpy)3+3。當(dāng)檢測(cè)電位在小于1.10V時(shí)，光信號(hào)為零。在1.10～1.30V范圍內(nèi)變化時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度隨著檢測(cè)電位的增加而增加，當(dāng)檢測(cè)電位為1.22V時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，而后隨著檢測(cè)電位的增加而減小，故選擇1.22V為檢測(cè)電位。
2.2.2 檢測(cè)池中溶液濃度及其pH值對(duì)ECL光強(qiáng)的影響
檢測(cè)池中聯(lián)吡啶釕及磷酸鹽緩沖液的濃度、pH值對(duì)發(fā)光強(qiáng)度有影響。實(shí)驗(yàn)研究了3～50mmol/L聯(lián)吡啶釕濃度的變化對(duì)ECL光強(qiáng)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)聯(lián)吡啶釕的濃度為5mmol/L時(shí)可以得到較大的ECL光強(qiáng)，當(dāng)其濃度大于5mmol/L時(shí)基線開始漂移，選取其濃度為5mmol/L。當(dāng)磷酸鹽緩沖液濃度為50mmol/L時(shí)有較大的ECL光強(qiáng)，故選擇檢測(cè)池中釕聯(lián)吡啶的濃度為5mmol/L，磷酸緩沖溶液濃度為50mmol/L。
聯(lián)吡啶釕在弱堿性溶液中有較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。當(dāng)磷酸鹽緩沖液的pH值在4.5～9.5范圍內(nèi)變化時(shí)，三種藥物的ECL光強(qiáng)也隨之顯著變化，當(dāng)pH值為8.5時(shí)光強(qiáng)達(dá)到最高峰，故選擇檢測(cè)池中緩沖液的pH值為8.5。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 方法回收率
按處方比例，取三種主藥成分及各種輔料配制成樣品后，測(cè)定三種組分的回收率。磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸溴苯那敏的平均回收率分別為100.4 %，99.8%，101.9%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)分別為2.2%，1.9%，3.1%(n=5)。結(jié)果表明，三種組分的回收率均較好，RSD較小，說明該分析方法是準(zhǔn)確可靠的。
2.3.2 線性范圍
以時(shí)間t(s)為橫坐標(biāo)，以ECL光強(qiáng)為縱坐標(biāo)記錄1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液的電泳圖(圖2)。根據(jù)處方的比例，將三種主藥成分配制成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，依次進(jìn)行毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光分析，確定方法學(xué)考察各參數(shù)(表1)。
2.3.3 配制溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
在本實(shí)驗(yàn)條件下，配制溶液具有較好的穩(wěn)定性，同一溶液連續(xù)3d內(nèi)分別進(jìn)樣(n=12)�？纱駿CL光強(qiáng)峰日內(nèi)RSD為2.89%，日間RSD為3.01%;麻黃堿ECL光強(qiáng)峰日內(nèi)RSD為3.32%，日間RSD為4.22%;馬來酸溴苯那敏峰ECL光強(qiáng)峰日內(nèi)RSD為3.76%，日間RSD為4.73%。表1 復(fù)方磷酸可待因溶液中三種化合物的線性范圍、回歸方程及檢測(cè)限(略)
2.3.4 空白輔料及其他成分的干擾實(shí)驗(yàn)
按處方比例配制除去三種主藥以外的空白溶液，用與含量測(cè)定項(xiàng)下相同的方法處理樣品，得到一空白供試品溶液。在本實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，得到該空白供試液電泳圖基本為一條無明顯峰的直線，說明其他組分都沒有電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，不干擾三種藥物的含量測(cè)定醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站f1411.cn。
配制與處方濃度相當(dāng)?shù)挠鷦?chuàng)木酚甘油醚溶液。在本實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，得到該溶液電泳圖基本為一條無明顯峰的直線，說明其沒有電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，不干擾三種藥物的含量測(cè)定。
2.4 三種藥物發(fā)光機(jī)理的探討
體系中存在的三種待測(cè)藥物具有一定還原性，當(dāng)對(duì)電極施加一個(gè)合適的氧化電位時(shí)，Ru(bpy)2+3被氧化成為Ru(bpy)3+3，同時(shí)三種待測(cè)藥物也在電極上被氧化，并進(jìn)一步生成還原型產(chǎn)物。該產(chǎn)物與Ru(bpy)3+3發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)2+3^，Ru(bpy)2+3^返回基態(tài)時(shí)釋放出光子，其氧化還原型電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可能機(jī)理是(Analyte 表示三種待分析物)：
