實驗五 血痕檢驗
一、血痕預(yù)試驗
【目的要求】
熟悉掌握聯(lián)苯胺試驗的原理和方法；了解其它檢測血痕預(yù)試驗的原理及方法。
【實驗內(nèi)容】
檢驗血痕應(yīng)先作預(yù)試驗，包括聯(lián)苯胺試驗、酚肽試驗、愈創(chuàng)木酯試驗、孔雀綠試驗、鄰聯(lián)甲苯胺試驗、氨基比林試驗、魯米諾試驗、紫外線濃硫酸試驗及紙色譜法等。血痕預(yù)試驗的基本原理是血痕中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過氧化物酶活性，遇H2O2可使之分解成H2O與新生態(tài)氧，后者可使某些化學(xué)物質(zhì)氧化，形成氧化產(chǎn)物而呈顏色反應(yīng)。某些植物汁中也含有某種具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可使預(yù)試驗發(fā)生陽性反應(yīng)。氧化劑也可直接氧化某些化學(xué)物質(zhì)，故預(yù)試驗陽性只能說明被檢斑痕可能是血痕，但不能確證為血痕，陰性則可排除血痕。
（一)儀器設(shè)備及試劑
1．儀器設(shè)備
剪刀、凹玻片
2．試劑
（1)聯(lián)苯胺無水乙醇飽和液
取聯(lián)苯胺1g置于棕色瓶內(nèi)，加20ml無水乙醇，置于50℃溫箱中2h助溶，然后降至室溫。此時大部分聯(lián)苯胺已溶解，上清液即為聯(lián)苯胺無水乙醇飽和液，置于4℃冰箱種備用。
（2)冰醋酸
（3)3%過氧化氫
（二)檢材
血痕、果汁斑、唾液斑、植物汁斑、高錳酸鉀、尿液、痰液
（三)聯(lián)苯胺試驗原理
血痕中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過氧化物酶活性，能使H2O2分解成H2O與新生態(tài)氧，后者使聯(lián)苯胺氧化成翠藍色的聯(lián)苯胺蘭。
（四)實驗方法
1．剪取或刮取檢材少許，置凹玻片孔內(nèi)或小濾紙片上。
2．加冰醋酸1滴，然后加聯(lián)苯胺無水乙醇飽和液1滴。
3．1-2分鐘后，若不出現(xiàn)蘭色反應(yīng)，再加3%H2O2 1滴，立即出現(xiàn)翠蘭色為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。
4．血痕與唾液斑、果汁斑、植物汁斑、尿液、痰液、高錳酸鉀等的實驗結(jié)果，并進行討論。
【注意事項】
1．必須嚴格遵守加試劑的順序
2．本試驗方法靈敏，微量檢材即夠，嚴禁在檢材上滴加試劑作反應(yīng)，以免破壞檢材。
3．取檢材時，應(yīng)防止相互污染。
【思考題】
1．苯胺試驗陽性，是否證明檢材含有血？為什么？
2．本試驗為什么必須嚴格遵守加試劑的順序？
二、血痕確證試驗
【目的要求】
熟悉掌握高山氏結(jié)晶試驗的原理和方法；了解其它檢測血痕確證試驗的原理及方法。
【實驗內(nèi)容】
確證試驗的目的是確證檢材是否為血，主要依據(jù)是檢材中是否含有血紅蛋白或其衍生物。
（一) 儀器設(shè)備及試劑
1． 儀器設(shè)備
載玻片、分離針、小刀、蓋片、顯微鏡。
2．試劑
高山氏試劑：混合10% NaOH 3ml，30%葡萄糖10ml，吡啶3ml，置于棕色滴瓶內(nèi)。放4℃冰箱12-24小時即可使用，如果試劑放置過久，將會失效。
（二)原理
血痕中的血紅蛋白在堿性溶液中分解為正鐵血紅素和變性珠蛋白，在還原劑葡萄糖的作用下，正鐵血紅素還原成血紅素，與變性珠蛋白或其它含氮化合物如吡啶結(jié)合，形成血色原結(jié)晶。
（三)實驗方法
1. 取檢材少許（如系織物，取纖維1－2mm，如系血痂，刮下1－3mm)置于玻片上，用分離針將纖維分離或?qū)⒀鑹核椤?/P>
2．蓋上蓋玻片，沿蓋片邊緣滴加試劑1至2滴（不要擠壓或移動蓋玻片)，鏡檢，產(chǎn)生橙紅色星狀，菊花狀或針狀的結(jié)晶，為陽性反應(yīng)。
【注意事項】
1．本法操作簡便。缺點是試劑容易失效，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。一般檢驗以前，先用已知血痕試驗，出現(xiàn)陽性結(jié)果，說明該試劑可以使用，反之不能使用。
2. 無結(jié)晶形成，可將玻片置于酒精燈上稍加熱，促使結(jié)晶形成，冷后鏡檢，或?qū)⒉Ｆ檬覝刂?0min，再行檢驗。
三、血痕的種屬鑒定
【目的要求】
熟悉掌握環(huán)狀沉淀反應(yīng)的原理和方法；了解其它檢測血痕種屬試驗的原理及方法。
【實驗內(nèi)容】
血痕種屬鑒定是血痕檢驗的關(guān)鍵步驟之一，種屬鑒定有許多方法，包括血清學(xué)方法、細胞學(xué)方法、分子生物學(xué)方法及生物化學(xué)方法。以血清學(xué)的沉淀反應(yīng)最為簡便實用。
（一)儀器設(shè)備及試劑
1. 儀器設(shè)備
毛細吸管、小試管、沉淀管、小燒杯、試管架、沉淀架、小剪刀、鑷子、大頭針、顯微鏡、離心機、水浴鍋。
2. 試劑
抗人血清、抗人血紅蛋白血清，生理鹽水，發(fā)煙硝酸，5%冰醋酸，5%黃血鹽（亞鐵氰化鉀)溶液。
（二)實驗方法
1. 血痕浸出液的制備
(1) 取血痕檢材0.5cm2，剪碎置試管內(nèi)，加0.5ml生理鹽水，浸泡血痕2-12小時。離心，吸取上清即為血痕浸出液。血痕浸出液應(yīng)澄清、透亮、呈淡草黃色。
(2) 血痕浸出液蛋白含量的測定：
Ⅰ. 觀察浸出液衛(wèi)生資格考試網(wǎng)的顏色，如呈淡執(zhí)業(yè)藥師草黃色相當于1/1000。
Ⅱ. 猛烈震蕩浸漬液，若液面上產(chǎn)生的泡沫能持續(xù)10秒，蛋白濃度約為1/1000。
(3) 黃血鹽冰醋酸法稀釋血痕浸出液
I. 取試管20支，分兩排放置于試管架上；
II. 將上次的血痕浸出液離心沉淀后，在第一排試管中 以二、五稀釋法稀釋。
III. 將第一排各管中的稀釋液，從后向前依次吸出1/2放入相對的第二排管中。
IV. 在第一排各管中，逐管加入5%黃血鹽溶液和5%冰醋酸各1滴，觀察在哪一管混濁剛剛消失，即該管含蛋白量相當于1/1000，用二五稀釋人血清至5000倍，作為對照。
(4) 硝酸毛細管法稀釋血痕浸出液
I. 如上所述，用二、五稀釋法將檢材浸液作適量稀釋
II. 用毛細管插入血痕浸出液中，待液面上升到1-1.5cm 時取出，用棉球輕輕擦去管外液體。
III. 在將此毛細管插入到發(fā)煙硝酸中，取出后襯一黑紙，觀察兩液面接觸處，有無白色混濁。
IV. 依次逐管稀釋，至二液接觸面有很薄的白環(huán)，并略帶云霧狀，該管的含蛋白量約為1/1000。
2. 環(huán)狀沉淀反應(yīng)
(1) 取沉淀管1支，加入抗人血紅蛋白（或抗人血清)沉淀素血清約0.1ml。
(2) 吸取經(jīng)測定蛋白含量約1/1000（或低于1/1000)檢材浸出液小心地重疊于抗血清上。
(3) 立即觀察沉淀管內(nèi)兩液體之間的界面有無白環(huán)出現(xiàn)，再經(jīng)5、10、15、30、60分鐘各觀察一次，如在60分鐘時仍無白環(huán)出現(xiàn)即為陰性。
(4) 取無血痕部位的空白檢材，已知人血痕、動物（如雞、豬血痕等，用同樣的方法制備浸出液，同法進行沉淀試驗，以保證種屬試驗的準確性。
一個完整的種屬試驗應(yīng)當包括必要的對照和當?shù)爻Ｒ姷幕蚺c檢案有關(guān)的動物血痕：血痕浸出液、無血痕空白檢材浸出液、已知人血痕浸出液、生理鹽水、動物血痕1浸出液、動物血痕2浸出液。
3. 抗人血紅蛋白（或抗人血清)瓊脂糖免疫擴散試驗
（1) 剪取1mm長的學(xué)血痕纖維備用。
（2) 把瓊脂糖凝膠放于沸水浴中使其溶解。
（3) 用小燒杯一只，盛少許熱水（約60℃)把小試管一只放入燒杯中，用兩支口徑相同的毛細吸管分別按3:1的比例把人血紅蛋白沉淀素血清和瓊脂糖凝膠加于試管（即3滴血清1滴瓊脂糖混勻后，即吸出一滴于載玻片上（成一圓點狀)迅速用鑷子夾取血痕纖維埋于瓊脂糖中央并在纖維面上補加瓊脂糖血清少許。
（4) 待瓊脂糖凝固后，把玻片放于濕盒中，在15、30、60分鐘時把玻片取出，在暗背景斜光照的條件下，觀察血痕纖維周圍的瓊脂糖內(nèi)是否有圓形、橢圓形、啞鈴型或弧形的灰白色的沉淀環(huán)出現(xiàn)，若血痕太陳舊或太淡薄，則觀察時間可延長至24小時。
（5) 24小時內(nèi)有暈環(huán)出現(xiàn)為陽性，否則為陰性。
每次檢驗均以空白檢材、已知人血痕和動物血痕作為對照。
