醫(yī)學免疫學-實驗指導

醫(yī)學免疫學實習指導

河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

免疫學教研室

二零零五年七月

實驗要求及實驗室規(guī)則

一、進入實驗室要穿白大衣，必要時要戴帽子和口罩。進入實驗室后要按規(guī)定位置就座，實驗課進行時，不準隨意出進。

   二、要保持實驗室安靜。實驗室絕對禁止飲食、吸煙、用嘴濕潤鉛筆和標簽等。實驗材料、動物等均需按規(guī)定處理，不要亂動亂放，未經許可，不得將實驗室的物品攜帶出室外。

   三、實驗室用的玻璃器材，如玻片、試管等，根據試驗要求，用前需用蠟筆馬上標記，如實驗日期、組別、姓名等，以免混淆。

   四、注意防火�；鹪床灰�接近易燃物品（如棉塞、酒精、二甲苯等)。實驗結束后，應檢查門、窗、水、電、火、防止發(fā)生事故。特別是實驗材料，一律不準帶出室外，以防意外，使用實驗器材、藥品要愛護，并注意節(jié)約。

   五、實驗完畢，整理實驗臺，將臺面器材、物品放回原處，用肥皂洗手后，再離開實驗室。

免疫學實驗課評分標準

實驗課學期總成績:20分，其中：

實驗報告——5分

平時成績——10分

期末考試——5分

各項判斷標準：

1、實驗報告

內容（原理、步驟、結果、討論)——4分

書寫（認真、詳細)——1分

2、平時成績

以10分為基準點，包括實驗完成情況（課堂提問、動手操作、實驗態(tài)度)、課堂紀律（著裝、遲到、早退、曠課)以及值日生表現等方面。

加分：

☆班長—— ＋0～1

√志愿者—— ＋1～2

扣分：

□上課沒穿白大衣—— -1

○未按要求完成值日任務—— -1

×遲到或早退1次—— -1

△未按時交實驗報告—— -1（如為抄襲，雙方均 -1分)

？曠課1次（無班主任或醫(yī)生的證明)—— -2；

曠課3次或3次以上本學期試驗課記為0分。

3、期末考試

以試卷實際成績?yōu)闇省?/p>

備注： （1)總分以20為限，超出不再累計；

（2)如有特殊情況，須請示主任及實驗負責老師后，方可酌情處理。

備注：任課老師在免疫實驗課評分中可參考以上評分標準靈活應用，實事求是的打分！

實驗一 凝集反應

實驗性質：驗證性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

一、ABO血型的測定（直接凝集玻片法)

（一)實驗目的 了解ABO血型鑒定的原理；掌握玻片凝集試驗的方法。

（二)實驗原理  已發(fā)現人類紅細胞有20多種血型系統，其中ABO血型系統在輸血中最為重要，必須血型相合才能輸血。血型鑒定是根據人類紅細胞表面有不同的血型抗原，故用已知的抗A、抗B單克隆抗體作直接玻片凝集試驗，可測定血型。

（三)實驗材料 

1、診斷用抗A及抗B單克隆抗體試劑各一支。

2、玻片、無菌刺血針、消毒用碘酒、酒精、無菌棉簽、牙簽，記號筆等

（四)實驗方法

1、取潔凈玻片一張用蠟筆分成兩半，分別標記A、B，然后A側滴一滴抗A抗體（藍色)，B側滴一滴抗B抗體（黃色)

2、被檢者耳垂或手指用碘酒消毒，酒精脫碘并涼干后，用刺血針刺血。

3、用牙簽刮取兩滴血液充分與兩種抗體混勻，即可觀察結果

（五)實驗結果

血 型 鑒 定 結 果

（六)注意事項

1、A、B兩側不能混，否則結果不可靠。

2、無菌觀念：消毒按一定方向，以一點為中心，由內向外；注意酒精脫碘，否則損傷皮膚、色素沉著；酒精脫碘后，要晾干，否則進針會有燒灼疼痛；

二、試管直接凝集（直接凝集試管法)

（一)實驗目的  了解試管凝集的反應；掌握倍比稀釋的方法和血清凝集效價的定義。

（二)實驗原理  試管法是一種定量試驗的經典方法。可用已知抗原來檢測受檢血清中有無某抗體及抗體的含量。用來協助臨床診斷或供流行病學調查研究。用已知的定量抗原與一系列倍比稀釋的待檢血清，在試管內混合，經一定的時間保溫靜止后，出現凝集，通過觀察各管的凝集程度，可定量檢測血清中的抗體水平。通常以產生明顯凝集現象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價，亦稱為滴度

（三)實驗材料 

1、抗原：滅活傷寒桿菌“H”菌液一管

2、抗體：傷寒桿菌H免疫學清

3、生理鹽水

4、試管、吸管、試管架、水浴箱等

（四)實驗方法

1、取試管7支，編號1-7,每加生理鹽水0.5ml。

2、于第一管中加入傷寒桿菌免疫學清0.5ml，吹吸混勻6次；取出0.5ml加入第二管，吹吸混勻6次；再取0.5ml加入第三管，依次類推至第六管，吸出0.5ml棄之。第七管不加血清，作為對照。

3、各管分別加入傷寒桿菌“H”菌液0.5ml，震蕩混勻。

4、置50℃水浴箱溫育2小時，輕輕取出試管，觀察結果。

（五)實驗結果

1、++++：細菌全部凝集，凝集塊完全沉于管底，液體清晰透亮。

2、+++：細菌大部分凝集，凝集塊沉于管底，液體稍渾濁。

3、++：細菌部分凝集，管底凝集物較前兩者少，仍明顯，液體半澄清。

4、+：液體渾濁，液體中可見非常小的凝集物，須仔細觀察才能發(fā)現。

5、—：無凝集物，液體渾濁度與對照管相同。

（六)注意事項

1、取樣加樣準確。

2、控制溫度，過高（超過55℃)，可導致抗體的破壞。

3、由水浴箱取出試管時，勿震動，避免凝集物懸起，影響結果的觀察。

4、觀察結果要與對照管比較后判斷，避免凝集是因為自凝導致的。

三、間接凝集抑制實驗（妊娠診斷實驗)

（一)實驗目的  掌握間接凝集抑制實驗的原理及方法；掌握妊娠診斷實驗的操作過程

（二)實驗原理  將可溶性抗原或相應抗體預先混合作用后, 再加入該抗原致敏的載體顆

粒，由于抗體已被可溶性抗原結合,阻斷了抗體與載體上的抗原作用,不再出現凝集現象,稱

為間接凝集抑制試驗。孕婦末次月經后40-90天左右尿液中（人絨毛膜促性腺激素)含量增

高，若將一滴孕尿，加一滴抗血清（HCG免疫家兔獲得)，充分反應后，再加一滴乳膠抗原，

不出現凝集顆粒，為妊娠試驗陽性，反之，則為陰性。

（三)實驗材料

1、孕婦尿液、正常尿液

2、膠乳抗原、抗血清（兔抗人HCG的抗體)

3、玻片、牙簽、滴管

（四)實驗方法

1、取一張玻片，用蠟筆分成兩半，標記“+”，“-”。

2、“+”側加一滴孕尿，“—”側f1411.cn加一滴生理鹽水（作為對照)。

3、兩側各加一滴抗血清（抗HCG)，輕輕晃動玻片0.5-1min。

4、兩側再加一滴膠乳抗原，分別混勻，放置5min，強光下觀察結果。

（五)結果觀察

1、“+”側呈均勻渾濁乳液，為妊娠實驗陽性；

2、“-” 側出現均勻一致的白色細沙樣顆粒，為妊娠實驗陰性

（六)注意事項

1、膠乳抗原使用前應混勻。

2、加入的尿標本、抗血清和膠乳抗原每滴大小一致。

3、加入抗血清后，充分混勻使可溶性抗原與抗體充分反應。

實驗二 沉淀反應

實驗性質：驗證性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

一、環(huán)狀沉淀試驗(ring precipitation test)：即沉淀反應的試管法。

（一)實驗目的：了解環(huán)狀沉淀實驗的原理及用途；了解簡單快速測定微量抗原的方法

（二)實驗原理：在小口徑（直徑小于0.5cm)試管內（現用環(huán)沉管)先加入未稀釋的已知抗血清，再小心加入稀釋的可溶性待檢抗原于血清層上面，使之成為分界清晰的兩層，陽性者，數分鐘后在抗原與抗體相遇界面處出現白色沉淀環(huán)，此實驗稱為環(huán)狀沉淀試驗。

應用：常用于鑒定微量抗原，如法醫(yī)學鑒定血跡；細菌分型等。特點：此法簡便易行，需用材料較多（用抗體較多，且應用效價較高的抗體)是其缺點。

（三)實驗材料

1、抗原：綿羊血清、豚鼠血清

2、抗體：抗綿羊血清

3、生理鹽水、環(huán)沉管、環(huán)沉管架、毛細滴管

（四)實驗方法

1、用毛細滴管在3支沉淀管中加抗體（0.2ML抗綿羊血清)。

2、毛細滴管分別加1：40、1：320稀釋的抗原、NS，沿管壁緩緩加入，使成明顯界面。

3、小試管置于架上，室溫放置數分鐘后，觀察兩液面交界處有無白色沉淀環(huán)。

（五)注意事項

1、抗原：抗體=1：1（體積比)。

2、加抗體時伸入試管底部。

3、加抗原時沿管壁緩緩加入。

4、用豚鼠血清和生理鹽水做抗原的對照。

二、對流免疫電泳：(counterimmunoelectrophoresis,CIE)

（一)實驗目的：掌握對流免疫電泳的原理、方法和結果分析

（二)實驗原理：

雙向瓊脂擴散與電泳技術相結合的方法。

1、半固體瓊脂凝膠：沉淀反應是在半固體瓊脂凝膠中進行的。半固體瓊脂猶如網狀支架，內含大量水分，可溶性抗原和抗體可在其中自由擴散。

2、電泳：指液體中的帶電顆粒在外加電場影響下的移動現象叫電泳。

3、電滲：是電場中溶液對于固體的相對移動。

在本實驗中：瓊脂是酸性物質，所使用的緩沖液是pH8.0的巴比妥緩沖液，因此在堿性溶液中，固體瓊脂帶負電；而與它接觸的溶液帶正電，因此液體向陰極移動，產生電滲。 

在瓊脂電泳中，電滲與電泳同時發(fā)生，物質的最終運動方向取決于合力的方向。液體的流動均勻而緩慢，一般不致影響帶電顆粒的電泳方向。但如果帶點顆粒帶電荷少，泳動速度慢，電滲作用占主導。

4、液體的pH值高于顆粒的等電點時顆粒帶負電荷，溶液的pH值離某物質的等電點越遠，該物質帶的電荷越多。

在本實驗中：

緩沖液：是pH8.0的巴比妥緩沖液。

抗原：等電點4—6，帶負電。

抗體：等電點6.8-7.2,帶負電少

分子量大，泳動速度慢

電滲作用大于電泳作用

5、負極側：加抗原在電場作用下從陰極向陽極移動

正極側：加抗體在電滲作用下從陽極向陰極移動  

在比例最適處形成白色沉淀線。

6、電泳的目的：限制了抗原抗體向多方向的自由擴散；加速了泳動的速度，所以縮短了反應的時間，僅需30-60分鐘；靈敏度比雙向擴散高10-15倍；特異性不如雙向擴散，因為一對以上的抗原抗體系統產生的沉淀線易重疊。

（三)實驗材料

1、抗原：綿羊血清、豚鼠血清

2、抗體：抗綿羊血清

3、生理鹽水、瓊脂板、電泳槽、電泳儀、毛細滴管

（四)實驗方法

1、打孔

  +Ab  _Ag

用打孔器按照上述所示打孔（不要太靠邊，以防電泳時不好搭橋)。

2、加樣：加滿，不要溢出。

陽極加抗體，Ab：兔抗羊血清；

陰極加抗原，Ag：1:40；1:80；1:160稀釋的羊血清。

各濃度分別作兩份，上下兩組完全相同。

3、電泳：一起電泳。每cm寬度4mA，1個玻片約10mA，8個玻片約80mA。電泳40分鐘-50分鐘。搭橋應完全緊密接觸，以防電流不均而發(fā)生沉淀線歪曲

（五)注意事項

擴散時間要適當。時間過短，沉淀線不能出現；時間過長，會使已形成的沉淀線散開而出現假象。

（六)結果分析

1、沉淀線的位置由抗原抗體的濃度決定：若抗原與抗體的濃度相等，則沉淀線在兩孔中間；若抗體和抗原的濃度不等，則沉淀線靠近濃度低的一方。

2、沉淀線的形狀由抗原抗體的分子量決定：若抗原與抗體的分子量相當，則沉淀線成直線；若抗體和抗原的分子量不等，則沉淀線呈弧線，彎向（凹向)分子量大的一方。

三、單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)：

定量實驗，常用已知的抗血清測定未知量相應抗原。

（一)實驗目的：了解實驗原理及如何用此方法定量檢測抗原的含量

（二)實驗原理

將抗血清與瓊脂混勻，制成含抗體的瓊脂板，在瓊脂板上打孔，孔內加入不同濃度的抗原。因為抗體已與瓊脂混合，所以不會再擴散，只有抗原在瓊脂中由小孔向四周擴散，所以命名為單向免疫擴散試驗。擴散過程中，抗原抗體比例合適的部位形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直徑與加入的抗原濃度成正比。若先以不用濃度的標準抗原作單向擴散，以沉淀環(huán)直徑平方為縱坐標，抗原濃度為橫坐標，制成標準曲線。待檢抗原的量可從標準曲線中查出。

應用：常用于檢測體液中免疫球蛋白和補體各成分的含量。

（三)實驗材料

1、抗原：待檢人血清

2、生理鹽水、單向免疫擴散瓊脂板、毛細滴管

（四)實驗方法

1、（每大組一塊)在含有抗體的瓊脂板中分別加入4個不同濃度的抗原1、2、3、4（加滿但不要溢出)。

2、濕盒中室溫放置48小時后觀察結果。

四、雙向瓊脂擴散試驗 (double immunodiffusion)

（一)實驗目的：掌握實驗原理、方法、應用，正確解釋實驗結果

（二)實驗原理：抗原和抗體在相同的環(huán)境下自由擴散。在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體，抗原和抗體從小孔向四周擴散，當二者比例合適，形成免疫復合物的沉淀線。【若反應材料中有兩種以上的抗原抗體系統，則兩孔間可出現多條沉淀線。】

應用：檢測抗原或抗體的純度，滴定抗體的效價；臨床上常用于檢測AFP，作為原發(fā)性肝癌的重要診斷指標。

（三)實驗材料

1、抗原：綿羊血清、豚鼠血清

2、抗體：抗綿羊血清

3、生理鹽水、瓊脂板、毛細滴管

（四)實驗方法

1、打孔：

2、加樣：中間孔加抗體：兔抗羊血清

四周6個孔中各孔分別加入：1:40；1:80；1:160；1:320；1:640稀釋的抗原（羊血清)和生理鹽水，加滿但不要溢出；左右兩組相同，同時作兩份。

3、將瓊脂板置于濕盒中，室溫下放置24小時后觀察結果。

（五)結果分析

上面兩孔為抗原，下面一孔為抗體

⑴  ⑵  ⑶

1、兩抗原完全相同（接口處不象畫的這樣，而是較模糊，較粗)；

2、兩抗原孔抗原完全不相同；

3、兩抗原部分相同。

原因：擴散中抗原抗體形成的沉淀線是半滲透性的屏障，游離的抗原抗體各位于沉淀線的兩側，特異性抗原、抗體相遇結合形成的復合物沉淀于此線，而不對應的抗原抗體則可以自由通過此沉淀線。

五、示教實驗

（一)火箭電泳(rocket electrophoresis)：是單向擴散與電泳技術相結合的一種方法。

原理：抗體與瓊脂混合，制成瓊脂板，然后打孔，在孔內加入待檢抗原，然后電泳，待檢抗原在電場作用下泳動，當與瓊脂中抗體比例合適，形成沉淀線，隨抗原的量減少，沉淀帶越來越窄，因此形成錐行沉淀線。沉淀峰的高低與抗原的濃度成正比。

應用：可用于測定待檢標本中抗原的含量。

（二)免疫電泳(immunoelectrophoresis)：雙向擴散和電泳技術相結合。

原理 ：先將待測的可溶性抗原在瓊脂板的小孔中電泳，樣品中不同成分的分子量、所帶電荷不同，因此電泳可使其分布于不同的位置。然后在瓊脂板上與電泳平行的方向挖一橫槽，加入相應的抗血清，抗原抗體同時作自由擴散，在比例合適處形成沉淀線，根據沉淀線的數量、位置、形態(tài)進行分析樣品中成分和性質。（長槽內加的是針對各種抗原的混合抗體液。)

應用 分析抗原的組分，鑒定提取物濃度

特點 樣品用量少，特異性高，分辨力強等;

但如抗原中各組分含量懸殊時，不易全部顯示，因此敏感性略差

實驗三 補體溶血實驗

實驗性質：驗證性

實驗學時：2學時

學生分組人數：4-6人

一、實驗目的：了解溶血反應的原理，掌握溶血反應的基本操作方法

二、實驗原理：將綿羊紅細胞做抗原注射家兔體內，經一定潛伏期，家兔血清中即出現特異

性抗體，此種抗體稱溶血素，它可以與綿羊紅細胞結合，此時若加入補體，即可激活補體的

經典途徑，則呈現溶血現象。

三、實驗材料

1、溶血素（1：1000)、補體（1：30)、綿羊紅細胞（1%)、生理鹽水

2、試管、吸管、試管架等

 四、實驗方法

1、按下表將試管4支排成一排，

2、震蕩混勻，37℃水浴30分鐘。

五、實驗結果

實驗管因發(fā)生溶血而變紅色透明，其余管為紅細胞懸液。

六、注意事項

1、取樣品的吸管不可混用；加樣力求準確；

2、SRBC吹勻后再加；

3、補體穩(wěn)定性差：T、pH、連續(xù)吹打等都使活性下降，所以置于冰浴中，用時再取；加入補體后輕輕吹打。

實驗四 酶聯免疫吸附實驗(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)

實驗性質：綜合性

實驗學時：3學時

學生分組人數：4-6人

一、實驗目的：了解酶免疫標記技術的原理、種類和用途；熟悉和掌握用酶聯免疫吸附試驗檢測抗原或抗體的原理。

二、實驗原理：酶免疫測定是一種免疫標記技術，ELISA是將抗原抗體反應的特異性與酶對底物的高效催化作用結合起來,利用酶標記的抗原或抗體，在固相載體上進行抗原或抗體測定的方法。根據結合物中的酶作用底物后顯色，有色產物的量與待測抗原或抗體的量成正比，根據顏色變化判斷實驗結果，也可以用酶標儀測定光密度（OD)值作定量測定抗原或抗體。

三、實驗材料

雙抗體夾心法檢測乙肝表面抗原的試劑盒

四、實驗方法 按照說明書分配包被抗體的固相載體

1.實驗設計：每組8孔。設陽性對照2孔，陰性對照2孔，空白對照1孔，其余為待檢孔。

2.加樣：各待檢孔：分別加入50μL待檢標本1、2、3

陽性對照：每孔加一滴陽性對照液

陰性對照：每孔加一滴陰性對照液

空白對照：什么也不加。（用酶標儀測定時調零用)

3．各孔加酶標抗體50μL，空白對照不加。水平快速震蕩混勻1分鐘，37℃水浴30分鐘。

4．洗板：棄液 每孔加滿洗液 30秒鐘后甩去 拍干；重復4次。

5．顯色：每孔加底物液A液、B液各一滴，37℃水浴15分鐘。（此時為藍色)。

6．終止反應：每孔加終止液一滴（從水浴取出時為藍色，加入終止液后為黃色)。

7．觀察結果： 目測：顏色深淺；酶標儀定量：測定OD值。

8、判定標準：待檢標本測得OD值 ≥2.1 ×陰性對照OD值  （＋)；待檢標本測得OD值 ＜2.1 ×陰性對照OD值  （－)；若陰性對照陰性對照OD值＜0.05，按0.05計算。

五、注意事項

1、待檢標本為注射用疫苗，但仍需小心，不要弄到手上，若弄到手上應立即清洗。

2、37℃水浴時將各孔重新安裝到架子上，蓋膜，加入飯盒內，防止液體進入各孔。

3、棄液時，注意方向，不要讓各孔之間的液體交叉。

4、拍干：倒置于衛(wèi)生紙上，拍干，不要用紙伸入孔內吸液體。

5、底物液有毒，使用時小心。

6、實驗結束，不要清洗板孔，直接將各板孔（包括液體)及試劑倒入垃圾中，切勿到處放置。

實驗五 巨噬細胞吞噬試驗

實驗性質：綜合性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

一、實驗目的：了解巨噬細胞在非特異性免疫中的作用；觀察巨噬細胞吞噬異物的形態(tài)。

二、實驗原理：病原微生物、紅細胞等異物侵入機體或在體外與巨噬細胞接觸，巨噬細胞即進行吞噬。取細胞做涂片，鏡檢計算吞噬百分率和吞噬指數，可估計巨噬細胞的功能。

三、實驗材料

1、無菌生理鹽水、雞紅細胞

2、無菌注射器、吸管、載玻片、解剖器械、蠟盤等

四、實驗方法 每組一只小鼠（實驗前已腹腔注射5%淀粉溶液誘導巨噬細胞入腹腔)

1、腹腔注射：酵母菌（真菌)或雞紅細胞1ml/mice，輕揉腹部，放置30分鐘。（使巨噬細胞有足夠的時間游走到腹腔并吞噬)

2、打開腹腔：拖頸處死小鼠，固定在蠟盤上；打開腹腔，注射生理鹽水：2ml/mice（沖洗作用腹腔中的巨噬細胞)；吸管在腹腔兩側吸取腹腔液。

3、推片染色（瑞氏-吉姆薩染色)：

滴片 → 推片→自然干燥 →加染液一滴，混勻放置1分鐘（染液為甲醇配置，甲醇可起固定作用，不需再固定)→加一滴蒸餾水混勻放置3~5分鐘（稀釋后的染料易使細胞著色)自來水緩沖，沖至無浮色（必在染液干之前沖，否則會有大量的小藍點，即染料顆粒)    濾紙吸干玻片表面→ 鏡檢（油鏡)。

4、觀察：在高倍鏡即可（雞紅細胞是一些淡黃色、橢圓形有核的細胞；而數量較多，較大的圓形或不規(guī)則的細胞，其表面具有許多似刺毛狀的小突起(偽足)，即為巨噬細胞。慢慢移動玻片標本，仔細觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的過程。可見有的雞紅細胞(1-多個)緊附于巨噬細胞表面;有的巨噬細胞已將1~數個紅細胞部分吞入;有的巨噬細胞已吞入1個或幾個橢圓形的紅細胞;有的巨噬細胞內的紅細胞膜已被被消化，只看到紅細胞核。)

實驗六 外周血淋巴細胞分離

實驗性質：驗證性

實驗學時：2學時

學生分組人數：4-6人

、實驗目的：熟悉用密度梯度離心法的方法分離外周血淋巴細胞。

二、實驗原理：密度梯度離心法，根據外周血中PBMC比重與血液中其他成分比重不同，采用分離液分離淋巴細胞。本實驗用比重為1.077的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液（此為人外周血淋巴細胞分離液，分離豚鼠外周血也可以)。紅細胞和粒細胞比重最大，沉于分離液的下層；分離液比重稍高于淋巴細胞，所以PBMC在分離液上層；血漿和血小板密度最低，懸浮在最上層。

三、實驗材料 

1、聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液

2、肝素抗凝血、Hank^,s液

3、離心管、離心機、吸管、試管架

四、實驗方法

1、抗凝取血：豚鼠心臟取血2ml（能多取可以多取，可直接抽血致死)

肝素抗凝：針管中吸0.1—0.2 ml，并推拉針芯潤濕管壁，再推出少許使針頭充滿肝素

固定豚鼠：一手把兩個前爪壓在頸后，另一只手抓住兩后肢，把身體伸平，暴露胸部。

抽血：另一人用手指將心臟推向左側，大拇指找到心跳最強點（劍突上第4肋處)，肋間進針，邊扎邊抽，以免扎的過深或過淺。

2、等倍稀釋：2 mlHank’s液＋2 ml血液，吹吸混勻（目的：使血液不太粘稠，容易分離)

3、分離：先加入2 ml淋巴細胞分離液，再沿管壁緩慢加入4 ml已稀釋血液

4、離心：配平后，2000轉/分，離心20分鐘。離心結束出現可見分層現象.。

5、用吸管吸取淋巴細胞。

五、注意事項

1、取血：固定好，針頭不可左右晃動，以防劃破心臟，若改變方向需要回到皮下再換方向；推入試管時，要取下針頭，以免細胞破碎；

2、分離：先加分離液；分離液與未稀釋血液1：1；加入稀釋血液時，用滴管沿管壁緩慢加入，不要打散液面；

3、離心：天平調平――托盤調平――試管與套筒一起調平――轉速由慢到快。

實驗七 E玫瑰花環(huán)試驗

實驗性質：驗證性

實驗學時：2學時

學生分組人數：4-6人

一、實驗目的：了解E花環(huán)形成的原理，學會用E玫瑰花環(huán)試驗鑒定和計算T淋巴細胞的方法

二、實驗原理 

常人外周血T淋巴細胞表面有綿羊紅細胞受體，即E受體，（又稱CD2)，是T細胞特有的表面標志。在體外一定條件下，T細胞能直接與綿羊紅細胞結合，形成玫瑰花樣細胞團，稱為E玫瑰花環(huán)�？捎糜跍y定血液中T細胞數目，間接反映細胞免疫功能。

豚鼠的T細胞表面有兔紅細胞受體。避免豚鼠心臟取血不夠用，另取豚鼠胸腺（其中多為T細胞)做E玫瑰花試驗。需用小豚鼠，因為老豚鼠的胸腺已脂肪化。

三、實驗材料 

1、Hank^,s液、兔紅細胞懸液、戊二醛溶液、甲紫染液

2、 吸管、載玻片、解剖器械、蠟盤

四、實驗方法

1、取胸腺：處死豚鼠，仰臥位固定于臘盤，沿腹正中線剪開，可見氣管兩側各有一蠶豆大小的胸腺（質稍韌，肉色。確證：在玻片上涂幾下，加一滴甲紫，高倍鏡下觀察)。

2、研磨：銅網置于平皿中，取出胸腺置銅網上，在胸腺上滴加少量Hank’s液，用針芯輕輕研磨，使胸腺細胞通過銅網漏入液體中。

3、離心：吸取細胞懸液于離心管中， 1000轉/分，離心10分鐘，胸腺細胞沉積于管底。

4、調細胞濃度：棄上清，以Hank’s液調細胞濃度。

沉淀約0.1ml細胞壓積+ 2.9mlHank’s液（混勻)——細胞濃度約為3×10⁶/ml。

5、成花：取0.5ml胸腺細胞懸液＋0.5ml 1%兔紅細胞＋一滴小牛血清（保護細胞)，混勻， 500轉/分 離心5分鐘。

6、滴片：去少量上清，加一滴戊二醛（固定作用，防成花細胞分離)，輕輕晃動試管以剩余的上清懸起細胞。取一滴細胞懸液，滴玻片，加一滴甲紫，蓋蓋玻片，低倍鏡找到視野，高倍鏡觀察。

五、實驗結果

凡結合3個以上綿羊紅細胞的T淋巴細胞為E花環(huán)陽性細胞。記數200個淋巴細胞中形成E花環(huán)的淋巴細胞百分率，正常值為60%-80%。

六、注意事項

1、取胸腺：小心不要破壞血管，否則混淆視野；

2、研磨：不要干磨，也不要加液體過多。

3、成花后，以剩余上清重懸細胞動作要輕柔，否則花環(huán)散開。

實驗八 淋巴細胞轉化實驗

實驗性質：驗證性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

（一)實驗目的：體外淋巴細胞增殖反應實驗是檢測淋巴細胞功能的實驗方法。了解淋巴細胞轉化的實驗方法，掌握淋轉實驗結果的判斷。

（二)實驗原理 特異執(zhí)業(yè)護士網性抗原、抗CD3、抗TCR等單抗、絲裂原等均可刺激T淋巴細胞活化增殖，可通過觀察T細胞的活化增殖情況判斷T細胞的功能是否正常，進而反映機體細胞免疫功能是否正常。特異性抗原只能激活對應的T細胞克隆，所以常用絲裂原，如植物血凝素和刀豆蛋白刺激T細胞，美洲商陸用于刺激B細胞。

T淋巴細胞活化以后，可轉化成淋巴母細胞（P720：細胞體積變大，為一般淋巴細胞的3-4倍；胞漿豐富，有偽足樣突起，嗜堿，核周圍有一染色較淺的透明區(qū)，并有空泡；核膜清晰，染色質疏松，呈細網狀，有時可見1~3個核仁。除典型母細胞外，尚可見到過渡型細胞，這些細胞有上述1~2個特點，如染色質疏松，有核仁，胞漿嗜堿，但體積不大)。

T淋巴細胞轉化率的高低，可反映機體的細胞免疫功能水平。

   ³H標記的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR)摻入法；

常用檢測淋巴細胞轉化的方法：    MTT法   

鏡檢法（觀察細胞形態(tài)變化)

正常值：T細胞轉化率為60-80%；偏低：50-60%；降低：＜50%

形態(tài)學計數法即鏡檢法（全血)：淋巴細胞受絲裂原刺激后，在轉化為淋巴母細胞的過程中，細胞的形態(tài)、結構發(fā)生明顯的改變，通過染色鏡檢，即可計算出淋巴細胞的轉化率。

（三)實驗方法：

1)  于無菌小瓶中加入肝素抗凝血0.3ml，1640培養(yǎng)液2.7ml，絲裂原0.1ml（最終濃度為25～50μg／ml)或NaCl對照液0.1ml，每種絲裂原及對照均設4瓶。（在超凈臺操作)；

2)  37⁰C溫箱培養(yǎng)3天；

3)  將培養(yǎng)物搖勻，移入離心管內，1000 r／min離心10 min，棄上清。取沉淀細胞做推片，自然干燥后，加甲醇固定3～5min，低溫保存。

4)  姬－瑞氏染色，先加染液1 min后，加等量pH6.9磷酸鹽緩沖液稀釋，繼續(xù)染15～20min，自來水沖洗，吸干后油鏡觀察。

5)  形態(tài)結果：

成熟淋巴細胞：與外周血淋巴細胞形態(tài)一致，胞核的染色質密集，無核仁，胞漿少，清度嗜堿性。

過渡型淋巴細胞：比成熟淋巴細胞略大，染色質同樣致密，但有明確的核仁1～2個，細胞將增多，染色偏深。

淋巴母細胞：細胞增大，形態(tài)不規(guī)則，核染色質疏松，核也增大，有明確的核仁1～3個，胞漿幅度增大，也可看到空泡。

   6)計數200個淋巴細胞，計算出淋巴細胞轉化率

MTT比色法（單個核細胞)：四甲基偶氮唑藍（MTT)在活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶作用下，被還原成藍黑色的甲臢，形成甲臢的量與細胞增殖程度呈正相關。因此通過測定細胞形成甲臢的量，可間接定量分析細胞的增殖情況。

取分離出的單個核細胞層，配成5×10⁶／ml，加3 ml，再加0.1ml絲裂原，加鹽水對照，培養(yǎng)70h后，加10μlMTT，混勻后，培養(yǎng)4～6小時。細胞培養(yǎng)終止后，加酸化異丙醇0.1 ml，充分混勻，靜置數分鐘，按MTT比色法測OD值。

計算SI：SI＝試驗孔的OD均值／對照孔的OD均值。

實驗九 T亞群鑒定

實驗性質：綜合性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

一、人外周血淋巴細胞分離

實驗方法：

1、取血2ml。

2、等倍稀釋：2 mlHank’s液＋2ml血液，吹吸混勻。

3、分離：先加入2 ml淋巴細胞分離液，再沿管壁緩慢加入4ml已稀釋血液。

4、離心： 2000轉/分，離心20分鐘。

5、吸取淋巴細胞，加入5倍體積Hank’s液洗滌，1500轉/分，離心5分鐘。

6、棄去上清，再加入5倍體積Hank’s液洗滌，1500轉/分，離心5分鐘。

7、倒掉上清，以回壁的上清重懸細胞，在劃圈的玻片上滴片，吸起，快速冷風吹干，密封，收回。（分3組)

二、 T淋巴細胞亞群的檢測

實驗性質：驗證性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

（一)實驗目的：熟悉并掌握利用APAAP法對外周T淋巴細胞亞群檢測的方法。

（二)實驗原理：

T淋巴細胞是機體免疫系統內功能最重要的一大細胞群，在正常機體內各個淋巴細胞亞群相互作用，維持機體正常的免疫功能。T淋巴細胞亞群的分類方法中最常用的是根據表面標志，利用單克隆抗體將其分為不同功能亞群。本試驗利用單克隆抗體APAAP法試劑盒檢測T淋巴細胞亞群。

APAAP法即“堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶”橋聯酶染色法,是一項免疫組化技術：將鼠源的抗人T細胞亞群CD單抗與人T細胞結合，再用羊抗鼠的單抗起橋連作用：一個Fab段連接抗人T細胞單抗 一個Fab段連接APAAP復合物再通過復合物中的堿性磷酸酶催化底物顯色來判斷CD分子的存在，確定T細胞各亞群的數目。（如下圖)

一抗：鼠抗人T淋巴細胞的單抗（與待測抗原結合)；

二抗：山羊抗鼠球蛋白的單抗（起橋聯用)一個Fab段連接一抗，

一個Fab段連接APAAP復合物；

三抗（APAAP復合物)：鼠抗堿性磷酸酶的單抗和堿性磷酸酶形成的免疫復合物

三、實驗材料

1、劃圈筆、玻片、封口袋

2、固定液、底物液、堅固紅、復染液、生理鹽水(NS)、PBS

3、鼠抗人T亞群單克隆抗體：抗CD3⁺單抗、抗CD4⁺單抗、抗CD8⁺單抗

4、抗鼠IgG二抗

5、APAAP復合物

四、實驗方法

1、標本制備：從外周血中用密度梯度離心法分離單個核細胞，用NS洗滌細胞3次。取細胞懸液滴于玻片，再吸取液滴，剩一薄層細胞，快速冷風吹干，如不立即染色，封口袋密封，-20℃保存。（已完成)

2、固定：滴一滴固定液于標本上，固定2分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，濾紙吸干。

3、加一抗：分別加鼠抗人T細胞CD3、CD4、CD8單抗10μl，放濕盒37℃水浴溫育25分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，濾紙吸干。

4、加二抗：羊抗鼠IgG二抗10μl，放濕盒37℃水浴溫育25分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，吸干。

5、加APAAP復合物：10μl，放濕盒37℃水浴溫育25分鐘，PBS洗3次，甩棄多余PBS，濾紙吸干。

6、顯色：滴加底物液（底物液1ml+堅固紅1mg，混勻，充分溶解)20μl，放濕盒37℃水浴溫育15分鐘，自來水沖洗終止顯色。

7、復染：蘇木素復染液1滴，染色1分鐘，自來水洗。

8、結果觀察：高倍鏡下，細胞核為藍色，細胞表面有紅色標記物的細胞為陽性細胞，計數100－200個單個核細胞，計算陽性細胞百分率。

思考題

1、T細胞亞群的檢測有何意義？

2、其他檢測T細胞亞群的方法有哪些？

實驗十 免疫血清的制備與檢測

實驗性質：綜合性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

實驗要求：

根據已學過的知識，自行設計免疫血清的制備和檢驗程序(包括實驗材料、實驗方法)并進行檢測。

實驗項目：動物免疫，血清中抗體的檢測。

免疫血清的制備  免疫血清的制備是一項常用的免疫學實驗技術。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑(如用于制備免疫標記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應答性的機體，常可獲得高效價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素，應予重視。

一、原理　具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。

二、免疫方法　根據抗原的性質不同而異，我們制備小鼠抗羊RBC的抗體采用的是腹腔注射免疫。

三、實驗步驟：

1、  免疫小鼠：7天前（一般為5天，因為我們的實驗課一周一次)免疫小鼠（2%羊紅細胞0.2ml腹腔注射)；

2、  取外周血：摘除眼球取血于離心管內（一只小鼠用此法一般可收集1毫升血，每1毫升血可分離出0.3-0.4毫升的血清)。

3、  分離血清：血液室溫放置1小時后，分離血清，離心血清，1500轉/分，10-15分鐘（因為血清量少，不離心吸取血清時易吸上RBC。同時離心也可去除血清中的絲狀物)，取出血清，-20℃保存；（以下下節(jié)課做)

4、  溶血素活性測定：將受檢血清在試管內等倍稀釋，加入定量補體和羊紅細胞，孵育后觀察試管中的溶血反應，評價待檢血清中的抗體活性。（類似試管凝集反應)

⑴ 稀釋血清：從冰箱中取出血清，室溫放置至血清融化。血清用pBS緩沖液稀釋300倍，吹打混勻；

⑵  加液：取1ml稀釋后的血清，加入10%SRBC 0.5ml，補體1ml，對照管用緩沖液代替血清；

⑶  孵育：37℃恒溫水浴15-30分鐘，冰浴終止反應；

⑷ 測量結果：離心，2000轉/分鐘，10min，取上清1ml，都氏試劑（內含氫化物，可破壞RBC，以防止上清中混有的RBC影響檢測結果)3ml加于測試板中，混勻，酶標儀540nm測吸光度值。

實驗十一 體液免疫檢測

實驗性質：設計性

實驗學時：4學時

學生分組人數：4-6人

實驗要求：

要求學生自行設計檢驗程序(包括實驗材料、實驗方法)并進行檢測。

實驗項目：

1、用已知抗體鑒定未知細菌；

2、用已知抗原檢測雙份血清中的抗體效價；

實驗十二 小鼠細胞免疫功能的檢測

實驗性質：開放性

實驗學時：4學時

學生分組人數：隨機

實驗要求：小鼠細胞免疫功能分為固有免疫和適應性免疫兩大類，包括吞噬細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞等學生在所學知識的基礎上，結合實驗室具備的條件，設計出可行的實驗方法，可以檢測細胞數量，也可以檢測細胞功能，全面考察小鼠的細胞免疫功能。

實驗項目：自選

說明：本次實驗學生還可以根據自己的興趣選擇有關的實驗，教研室全力支持。

附錄（綜合和設計性實驗參考)

多克隆抗體的制備

抗體是機體在抗原刺激下所產生的特異性球蛋白。是免疫應答的重要產物，亦是免疫學實驗中常用的試劑，對于抗原的分析鑒定和定量檢測極為重要，在各種免疫學診斷中應用極為廣泛。目前人工制備的特異性抗體分為三種類型，即多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。多克隆抗體的制備是一項常用的免疫學實驗技術。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑(如用于制備免疫標記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應答性的機體，�？色@得高效價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素，應予重視。

  一、免疫動物

  （一)動物的選擇

  供免疫的動物有哺乳類和禽類，常選用家兔、山羊或綿羊、馬、騾和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的特性和所要獲得的抗體的量和用途。

（二)抗原及抗原計量的選擇

不同抗原的免疫原性強弱不一，這取決于其分子量、化學活性基團、立體結構、物理性狀和彌散速度等�？乖�的免疫劑量依照給予抗原的種類、免疫次數、注射途徑以及受體動物的種類、免疫周期及所要求的抗體特性等而不同。

（三)免疫方案

 抗原注射途徑可根據不同抗原及試驗要求，選用皮內、皮下、肌肉、靜脈、腹腔等不同途徑注入抗原進行免疫。以顆粒性抗原免疫小鼠為例，具體方案如下：

1.主要材料：健康昆明小鼠數只；2%羊紅細胞懸液

2.免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2ml 2%羊紅細胞懸液。7天后取外周血：摘除眼球取血于離心管內（一只小鼠用此法一般可收集1毫升血，每1毫升血可分離出0.3-0.4毫升的血清)。分離血清：血液室溫放置1小時后，分離血清，離心血清，1500轉/分，10-15分鐘（因為血清量少，不離心吸取血清時易吸上RBC。同時離心也可去除血清中的絲狀物)，取出血清，如不立即鑒定，-20℃保存

3.抗血清的鑒定：溶血素活性測定：將受檢血清在試管內等倍稀釋，加入定量補體和羊紅細胞，孵育后觀察試管中的溶血反應，評價待檢血清中的抗體活性。

⑴ 稀釋血清：從冰箱中取出血清，室溫放置至血清融化。血清用pBS緩沖液稀釋300倍，吹打混勻；

⑷  加液：取1ml稀釋后的血清，加入10%SRBC 0.5ml，補體1ml，對照管用緩沖液代替血清；

⑸  孵育：37℃恒溫水浴15-30分鐘，冰浴終止反應；

⑷ 測量結果：離心，2000轉/分鐘，10min，取上清1ml，都氏試劑（內含氫化物，可破壞RBC，以防止上清中混有的RBC影響檢測結果)3ml加于測試板中，混勻，酶標儀540nm測吸光度值。計算血清中抗體的效價。

附表

河北醫(yī)科大學設計（綜合)性實驗開題報告