生物化學與分子生物學-實驗指導:實驗八 心、肝、腎組織乳酸脫氫酶同工酶的電泳分離

實驗八  心、肝、腎組織乳酸脫氫酶同工酶的電泳分離

【實驗目的】

強化學生對電泳基本原理的理解與記憶；進一步熟記醋酸纖維素薄膜電泳分離蛋白質(zhì)的基本原理及操作；掌握乳酸脫氫酶（LDH)同工酶的組織特異性。

【實驗原理】

同工酶是指催化的化學反應相同，而分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及免疫學特性都不相同的一組酶。乳酸脫氫酶（LDH)是糖酵解過程中很重要的一種酶，其作用是催化丙酮酸與乳酸的相互轉(zhuǎn)化。LDH實際上是由幾種理化性質(zhì)及免疫學特性不相同而催化功能相同的蛋白質(zhì)分子組成的一組酶，統(tǒng)稱為乳酸脫氫酶同工酶。LDH酶蛋白分子是由四個亞基組成的四聚體，因LDH亞基的種類和數(shù)目不同，故有五種同工酶的分子形式，即：LDH₁、LDH₂、LDH₃、LDH₄和LDH₅，它們的組成、結(jié)構(gòu)和等電點均不同，在特定的pH條件下（一般為pH8.6)所帶電荷數(shù)量不同，在電場中泳動速度不同。當朝正極方向泳動時，最快的是LDH₁，依次為LDH₂、LDH₃、LDH₄，泳動最慢者是LDH₅。

不同組織中LDH同工酶的分布不同，有明顯的組織特異性。人的心肌、腎和紅細胞中以LDH₁和LDH₂最多，而肝和骨骼肌中則以LDH₅ 和LDH₄最多。脾、胰、甲狀腺和淋巴結(jié)等組織以LDH₃最多。正常人心肌和肝、腎組織提取液的LDH同工酶譜見圖2-3。

圖2-3  LDH同工酶譜示意圖

分離LDH同工酶常用的支持物有醋酸纖維素薄膜、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖及淀粉凝膠等。本實驗用醋酸纖維素薄膜為支持物，分離心肌、肝組織、腎組織提取液的LDH同工酶，其優(yōu)點是設(shè)備簡單、操作方便、標本用量少、電泳時間短及區(qū)帶分離清晰等。

電泳后，將醋酸纖維素薄膜復蓋于浸有底物（乳酸鈉)和顯色劑——吩嗪甲氧硫酸酯(phenazinemethosulfate，PMS)和氯化硝基四氮唑蘭（nitrobluetetraxolium，NBT)混合液的f1411.cn/sanji/醋酸纖維素薄膜上，37℃保溫，使酶起催化反應，可出現(xiàn)深淺不同的五條色帶，稱為同工酶譜。其顯色機制為：

健康人血清LDH同工酶的分布如下表：

 血清LDH同工酶是各組織釋放的LDH的總和，當某一組織受損時，它含有的LDH同工酶就會大量釋入血中，血清LDH同工酶譜表現(xiàn)出受損組織的LDH同工酶的特征。例如，血清LDH₁和LDH₂增高常見于心肌損傷；血清LDH₅增高常見于肝或骨骼肌有損傷。因此，血清LDH同工酶譜的改變能反映出疾病的部位和損傷的程度，有助于觀察病程的轉(zhuǎn)歸和判斷治療效果。

【實驗試劑和器材】

1．試劑

⑴ 心肌提取液：取新鮮兔心，除去附著的結(jié)締組織和脂肪，稱重，剪成碎片，放入研缽中，加入兩倍體積預先冰冷了的去離子水，磨成勻漿后取上清液點樣。

⑵ 肝（腎)組織提取液：取新鮮兔肝（腎)，稱重，加兩倍體積預先冰冷了的去離子水，放在研缽中磨成勻漿后取上清液點樣。

⑶ 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.5)：稱取Na₂HPO₄·7H₂O 22.55 g和KH₂PO₄ 2.16 g，蒸餾水溶解后稀釋至1000 mL。

⑷ 1 mol/L乳酸鈉：吸取乳酸鈉液（比重1.38 ~ 1.42，含量60 ~ 70%)5.3 mL溶于50 mL0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.5)中，混勻，冰箱保存。

⑸ 吩嗪甲氧硫酸酯（phenazine methosulfate，PMS)溶液（1mg/mL)。置棕色瓶中，4 ℃保存。對光敏感，呈綠色即不能使用。

⑹ 氯化硝基四氮唑蘭（nitrobluetetraxolium，NBT)溶液（3mg/mL)。

⑺ 染色應用液：1 mol/L乳酸鈉液0.8mL，3 mg/mL NBT 1.6 mL，1 mg/mL PMS0.6 mL，輔酶Ⅰ20 mg，臨用前配制。

⑻ 巴比妥緩沖液（pH8.6，離子強度0.05)：分別稱取巴比妥1.85克，巴比妥鈉10.3克，溶于100 mL蒸餾水，加熱助溶。待冷后傾入1000 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻。

2．器材

⑴ 電泳槽和電泳儀。

⑵ 刻度吸量管（1mL，2mL)。

⑶ 醋酸纖維素薄膜（6×3 cm)。

⑷ 點醫(yī)學全.在線f1411.cn樣器或血紅蛋白吸管。

⑸ 有蓋搪瓷盤。

⑹ 載玻片。

⑺ 電熱恒溫水浴。

【實驗步驟】

1．準備  在電泳槽的電極室內(nèi)加適量pH8.6巴比妥緩沖液并搭好濾紙橋。

2．加樣  準備甲、乙兩條6×3cm的醋酸纖維素薄膜，將甲條浸于pH8.6巴比妥緩沖液中充分浸透后取出，用濾紙將膜的多余水分吸干。用X光軟片為點樣器，在盛有組織提取液的表面皿內(nèi)蘸一下，使軟片下端均勻地粘附上組織提取液，然后緊按在無光澤面的距一端1.5cm的醋酸纖維素薄膜處，待樣品全部滲入膜內(nèi)，移開軟片。將點有樣品的薄膜置于電泳槽濾紙橋上，點樣面向下，點樣端放陰極。

3．電泳  通電，電壓150~170V，電流0.6~1.0mA/cm，電泳45分鐘。

4．染色  電泳結(jié)束前15分鐘配制染色應用液。將乙條薄膜浸入染色應用液中完全浸潤后取出，光面朝下，貼在玻璃片上。然后將甲條電泳膜取出，用濾紙迅速吸干兩端上的緩沖液，無光澤面朝下貼在乙條薄膜上，將玻片移入有蓋搪瓷盤內(nèi)，盤內(nèi)置濕紗布一條以保持盤內(nèi)一定濕度，于37℃保溫3~5分鐘，觀察藍紫色區(qū)帶，并比較三者的結(jié)果。

【實驗注意事項】

1. 所用儀器須絕對清潔，整個實驗過程必須控制溫度和時間，以求結(jié)果準確。

2. 緩沖液pH應準確，基質(zhì)液要新鮮配制。

3. 染色時應注意薄膜上的染液要適量，過多會導致同工酶區(qū)帶擴散，過少則會因為膜干燥而無法進行酶促反應。

4. 電泳溫度不能過高。若室溫超過25℃時則需用冰降溫，以免影響酶活力。

【思考題】

1．用什么方法可證明醋酸纖維薄膜有無電滲作用?

2．電場強度愈高蛋白質(zhì)在醋酸纖維薄膜上的泳動率愈高，是否電場愈高愈好?

3. 乳酸脫氫酶（LDH)的分子組成特點是什么？與電泳速度有關(guān)嗎？