生物化學與分子生物學-實驗指導:實驗十二 組織細胞基因組DNA的提取

實驗十二 組織細胞基因組DNA的提取

【實驗目的】

生物細胞DNA提取方法較多，本實驗熟悉生物細胞DNA提取方法的一種；掌握SDS使蛋白質變性而與DNA分離進行提取DNA的基本原理；熟悉SDS法提取DNA的基本操作過程。

【實驗原理】

生物組織中DNA是以DNA-蛋白質復合物的形式存在。在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白質溶解度小，RNA-蛋白質溶解度大；在濃NaCl溶液中，DNA-蛋白質溶解度大，RNA-蛋白質溶解度小；據此可分開DNA和RNA。

SDS（十二烷基硫酸鈉)，是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質的疏水部位，引起蛋白質構象改變，使蛋白質變性并與DNA分離；SDS也是一種良好的解離劑，可使蛋白質溶解，形成SDS-蛋白質復合物，并使復合物帶負電。

氯仿-異丙醇可以將蛋白質除去，離心后形成三層，上層為DNA、異丙醇和水；中層為蛋白質沉淀；下層為氯仿。適量的冷無水乙醇可使DNA沉淀析出。加入EDTA - 2Na（乙二胺四乙酸二鈉)可防止DNA酶的降解。

A₂₆₀/A₂₈₀比值可用于檢查DNA純度：A₂₆₀/A₂₈₀ ＝1.8，高純度DNA；A₂₆₀/A₂₈₀< 1.8，含蛋白質； A₂₆₀/A₂₈₀> 1.8，含RNA。

【實驗試劑和器材】

1. 試劑

⑴ 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA。

⑵ 5 mol/L NaCl。

⑶ 30% SDS。

⑷ 氯仿-異丙醇混合液。

⑸ 0.015mol/L NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉。

⑹ 冷無水乙醇。

2. 器材

⑴ 低速離心機。

⑵ 鑷子。

⑶ 剪刀。

⑷ 三角燒瓶。

【實驗步驟】

1. 提取脫氧核糖核蛋白

⑴ 取兔肝3克（2~3只小鼠)，15 mL 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA洗去血液。

⑵肝勻漿制備：將兔肝置乳缽中剪碎，加15 mL 0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA研磨勻漿，注意不要用力研磨。

⑶ 3000 rpm離心10分鐘，棄上清；沉淀加入0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA 15 mL輕輕混懸。

⑷ 3000 rpm離心 10分鐘，棄上清；沉淀加入0.14 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA 10 mL 使之溶解，轉至50毫升三角燒瓶中。

2. 去除蛋白質

⑴ 加入30% SDS 1 mL 混勻，60℃水浴輕搖15分鐘，取出冷至室溫。

⑵加入5 mol/L NaCl2.75 mL，輕搖10分鐘。

⑶加入氯仿-異丙醇19 mL（沉淀蛋白)，輕搖20分鐘，離心 250f1411.cn/sanji/0rpm10分鐘。

3. 提取DNA

⑴ 吸上清（水相)轉入玻璃離心管（含DNA)，棄沉淀（剩余物)。

⑵加入1.5倍體積冰乙醇（無水乙醇)輕搖至DNA析出。

4. 檢測

⑴ 用鑷子或玻璃棒取出置試管中，加入0.015 mol/LNaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉1mL。

⑵ 量取10~50 μL(用0.1 mL刻度吸管吸取) 原液，用0.015mol/L NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉稀釋到5 mL（稀釋100~500倍)。

⑶ 測A₂₆₀/A₂₈₀（用0.015 mol/L NaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉做空白溶液)。

5. 計算

⑴ DNA濃度：（μg/mL)=A₂₆₀×50×稀釋倍數

⑵ DNA純度：A₂₆₀/A₂₈₀

【實驗注意事項】

1．為盡可能避免DNA 大分子的斷裂，在實驗過程中必須注意：① 研磨時上下用力，應保持低溫，研磨時間應短，勿用玻璃勻漿器。② 實驗中使用的吸取DNA 水溶液的滴管管口需粗而短，并燒成鈍口。③ 抽提時勿劇烈振搖。

2．保醫(yī)學全.在線持DNA 活性，避免酸、堿或其它變性因素使DNA 變性。

3．加入氯仿—異丙醇后勿劇烈搖動，以免大分子斷裂。

4．有機溶劑對人體有害，操作時要注意。

【思考題】

1．如樣品中有蛋白質存在，其紫外分析結果有何表現(xiàn)?如何進一步純化？

2．DNA 的定量可采用那些方法?目前常用的是哪種?如何測定DNA 的含量？

3．從生物細胞中提取DNA 的主要注意點是什么?應如何控制？

4．能引起DNA 變性的因素有哪些？DNA 降解和DNA 變性有何區(qū)別？如何鑒別？