生物化學與分子生物學-實驗指導:實驗二十三 血清γ-球蛋白的分離純化與鑒定

實驗二十三  血清γ-球蛋白的分離純化與鑒定

【實驗目的】

電泳、層析、離心及分光光度分析等技術方法常常廣泛應用于生物樣品中各種生物分子和分離純化和鑒定。蛋白質的分離和純化是研究蛋白質化學及其生物學功能的前提和基礎。本實驗采用離心、層析和電泳等技術方法以分離純化和鑒定血清中的γ-球蛋白，涉及到生物化學和相關學科的多種技術的配套應用，從而達到訓練學生綜合性運用及掌握這些基本生物化學與分子生物學實驗操作技術的目的。本實驗還涉及到質量控制和效益分析，使培養(yǎng)貼近實用、強化能力。

實驗方案一

【實驗原理】

血清中蛋白質按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α₁-球蛋白、α₂-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量約占16％，100 mL血清中約含1.2 g左右。不同種類的蛋白質其分子量、溶解度，以及在一定條件下帶電荷的情況有所不同，可根據這些性質的差別，分離及提純蛋白質。

首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉淀分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經離心分離，沉淀部分即為含有γ-球蛋白的粗制品。

用鹽析法分離而得的蛋白質中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質進一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實驗采用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質與無機鹽類之間分子量的差異。當溶液通過SephadexG-25凝膠柱時，溶液中分子直徑大的蛋白質不能進入凝膠顆粒的網孔，而分子直徑小的無機鹽能進入凝膠顆粒的網孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會被阻滯而后洗脫出來，從而可達到去鹽的目的。純化后的γ-球蛋白可利用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定其純度。

【實驗試劑和器材】

1. 試劑

⑴ 飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨（ammonium sulfate)850g于1000 mL蒸餾水中，在70~80℃水浴中攪拌溶解，用濃氨水調pH為7.2，室溫放置過夜，瓶底析出白色結晶，上層液即為飽和硫酸銨溶液。

⑵ 0.01 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS)：稱取NaH₂PO₄·2H₂O 1.56 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為0.01 mol/L NaH₂PO₄液。稱取Na₂HPO₄·12H₂O3.58 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為0.01 mol/L Na₂HPO₄液。

取0.01 mol/LNaH₂PO₄液280 mL，加0.01mol/L Na₂HPO₄液720 mL，混勻即為0.01 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液。

⑶ 葡聚糖凝膠G-25（Sephadex G-25)：按每100 mL凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G-25干膠 25g。稱取所需量置于錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30 mL，用玻璃棒輕輕混勻，置于90~100℃水溫中時時攪動，使氣泡逸出。1h后取出，稍靜置，傾去上清液細粒。也可于室溫中浸泡24h，攪拌后稍靜置，傾去上清液細粒，用蒸餾水洗滌2~3次，然后加0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡，備用。

⑷ 10%三氯乙酸（acetocaustin)。

⑸ 納氏試劑（Nessler"s reagent)：① 貯存液：稱取碘化鉀(KI)7.58于250mL三角燒瓶中，用蒸餾水5mL溶解，再加入碘（I2)5.5 g溶解，加7~7.5 g Hg，用力振搖10 min(此時產生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100 mL容量瓶，洗滌沉淀，洗滌液一并倒入容量瓶內，用蒸餾水稀釋至100 mL。② 應用液：取貯存液75mL加10％NaOH 350 mL，加水至500mL，混勻，置棕色瓶內，靜置數日后取其上清液使用。

溶解115g HgI₂（mercuric iodide)和80g KI（potassium iodide)于蒸餾水中，稀釋至500 mL。加入500 mL6mol/L NaOH溶液，靜置后吸取上清液使用。試劑宜放置于陰涼處。

⑹ pH8.6，離子強度0.06巴比妥電極緩沖液（barbital buffer)：稱取巴比妥鈉（barbital sodium)12.76g，巴比妥（barbital)1.66 g，蒸餾水加熱溶解后再加水至1000 mL。

⑺ 氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B（amino black 10B)0.5 g，用甲醇50 mL，冰乙酸（glacial acetic acid)10 mL，蒸餾水40 mL溶解。

⑻ 漂洗液：95%乙醇45 mL，加冰乙酸5 mL及蒸餾水50 mL。

2. 器材

⑴ 電泳儀、電泳槽。

⑵ 電動離心機、層析柱。

⑶ 鑷子、培養(yǎng)皿、X光軟片、濾紙。

⑷ 離心管、燒杯、量筒、滴管、小試管、吸管。

⑸ 瓷比色盤（黑色和白色各一個)。

【實驗步驟】

1. 分段鹽析

⑴ 取血清1.0 mL加入離心管中，加磷酸鹽緩沖液（PBS)1.0 mL，混勻。再逐滴加入pH 7.2飽和硫酸銨液2.0 mL，邊加邊搖勻。靜置30分鐘后離心（3000 rpm×10分鐘)，傾去上清液（此液中主要含清蛋白)并盡量倒凈，沉淀為球蛋白。

⑵ 將上述離心管中的沉淀用1.0 mL PBS攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨液0.5 mL，混勻，靜置30分鐘后離心（3000 rpm×10分鐘)，傾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并盡量倒凈，其沉淀為初步純化的γ-球蛋白。如要獲得更純的γ-球蛋白，可重復此過程1~2次，最后用1.0 mLPBS將沉淀溶解。

2. 脫鹽

⑴ 裝柱：取層析柱（Φ1×20cm)，關緊下端出口，加蒸餾水少許，緩慢加入葡聚糖凝膠G-25懸液，待底部沉積1~2 cm厚的凝膠后，打開下端出口，繼續(xù)加入凝膠至凝膠沉積10~15 cm高，注意凝膠床表面應平整。凝膠柱經PBS流洗平衡后即可使用。

⑵ 上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床表面，關緊下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液，小心緩慢地沿層析柱內壁加到凝膠床表面上，注意不要破壞凝膠床表面的平整。打開下端出口，使樣品進入凝膠床，小心加入少許PBS于柱內，待進入凝膠床后再加入少許的PBS，如此重復三次，以洗凈柱內壁上的樣品溶液，然后可加入多量的P衛(wèi)生資格考試網BS進行洗脫，流速為4~5滴/分。

⑶ 收集：事先應準備好10支試管，于加樣開始后立即收集洗脫液。每收集約1.0 mL換一管。

⑷ 檢查：取瓷比色盤2個（一個為黑色背景，另一個為白色背景)，按洗脫液的管號順序分別取1滴滴于比色盤中，前者各加10%三氯乙酸5滴，出現白色混濁或沉淀者即有蛋白質存在；后者各加納氏試劑1滴，出現顏色反應者存在NH₄⁺。將檢查結果用“-，+，++”等符號記錄于下表中。選取蛋白含量高且不含銨離子的樣品液進行純度鑒定。

3. 純度鑒定

⑴ 取2×8 cm大小的醋酸纖維素薄膜2張，于巴比妥緩沖液中充分浸濕。將浸透的膜條鑷出后用濾紙吸去多余的水分，于無光澤面點樣。

⑵ 在距膜條一端約1.5 cm處，用X光軟片蘸取全血清和純化的γ-球蛋白樣品液分別點于兩張膜條上。如樣品液較稀，可多點幾次。

⑶ 將巴比妥緩沖液加于電泳槽內，再將點樣后的膜條放置于電泳槽槽架上，槽架上用四層濾紙作橋墊。放置時膜條的無光澤面應向下，點樣端置于陰極，膜條與濾紙需貼緊。

⑷ 接通電源，以150V恒壓電泳約45分鐘。

⑸ 通電完畢后，用鑷子將膜條取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染色1~2分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復漂洗數次，直到背景漂凈為止。用濾紙吸干膜條，比較純化前與純化后電泳圖譜的變化，以確定樣品的純度。

【實驗注意事項】

1. 裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務必做到凝膠懸液不稀不厚，一般濃度為l:l，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會出現氣泡或分層現象。加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。

2. 葡聚糖凝膠使用后如短期不再用，為防止凝膠發(fā)霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉，保存于4℃冰箱內。若長期不用，應脫水干燥保存，即將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干后，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時間，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然后用多孔漏斗抽干后，于60~80℃烘干貯存。

實驗方案二

【實驗原理】

首先利用硫酸銨分段鹽析法將血清中的γ-球蛋白與清蛋白及α、β-球蛋白分離，再用葡聚糖凝膠過濾法除鹽。脫鹽后的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點的不同可進行分離。

α-球蛋白、β-球蛋白的pI<6.0；γ-球蛋白的pI為7.2左右。因此在pH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進行層析時，帶負電荷的α-球蛋白和β-球蛋白能與DEAE纖維素進行陰離子交換而被結合；帶正電荷的γ-球蛋白則不能與DEAE纖維素進行交換結合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有γ-球蛋白，從而使γ-球蛋白粗制品被純化。其反應式如下：

用上述方法分離得到γ-球蛋白是否純凈單一，可將純化前后的γ-球蛋白進行電泳比較而鑒定之。

【實驗試劑和器材】

1. 試劑

⑴ 飽和硫酸銨溶液。

⑵ 0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)：A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄·2H₂O) 2.730 g溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000 mL。B液：稱取磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·12H₂O)6.269 g，溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000 mL。取A液77.5 mL，加于B液22.5 mL，混勻后即成。

⑶ 葡聚糖凝膠（Sephadex G-25)： 按“實驗方案一”溶脹后加0.0175 mol/L pH 6.3磷酸鹽緩沖液平衡。

⑷ DEAE-32(二乙基氨基乙基-32)纖維素：按100 mL柱床體積需DEAE纖維素14 g稱取，每克加0.5mol/L鹽酸溶液15mL，攪拌。放置30min(鹽酸處理時間不可太長，否則DEAE纖維素變質)。加約l0倍量的蒸餾水攪拌，放置片刻，待纖維素下沉后，傾棄含細微懸浮物的上層液。如此反復數次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積l mol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5 mol/L氫氧化鈉，攪拌后放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復洗至pH<f1411.cn/wszg/;7為止。虹吸去除上層液體，然后加入0.0175 mol/L pH 6.3磷酸鹽緩沖液平衡，備用。

⑸ 20%磺基水楊酸溶液。

⑹ 納氏試劑應用液。

⑺ 0.9％氯化鈉溶液。

⑻ 醋酸纖維素薄膜電泳有關試劑。

2. 器材

⑴ 電泳儀、電泳槽。

⑵ 電動離心機、層析柱2支。

⑶ 自動部份收集器

⑷ 鑷子、培養(yǎng)皿、X光軟片、濾紙。

⑸ 離心管、燒杯、量筒、滴管、小試管、吸管。

⑹ 瓷比色盤（黑色和白色各一個)。

【實驗步驟】

1. 鹽析

⑴ 取正常人血清2.0 mL于小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0 mL，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液4.0 mL，混勻后于室溫中放置10min，3000 r/min離心10 min。

⑵ 小心傾去含有清蛋白的上清液，重復洗滌一次，于沉淀中加入0.0175 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5~1.0 mL使之溶解。此液即為粗提的γ-球蛋白溶液。

2. 脫鹽

⑴ 裝柱：洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0 mL洗脫液。一次性將葡聚糖凝膠G-25從塑料接口加入層析柱內，打開柱底部出口，調節(jié)流速0.3 mL/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最后使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面并防止層析床內出現“紋路”。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時沖起膠粒。

⑵ 上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或濾紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25 mL/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床后再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然后可加入適量緩沖液開始洗脫。

加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5 mL/min，用自動部份收集器收集，每管1mL。

⑶ 洗脫液中NH₄⁺與蛋白質的檢查：取瓷比色盤2個（一個為黑色背景，另一個為白色背景)，按洗脫液的管號順序分別取1滴滴于比色盤中，前者各加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現白色混濁或沉淀者即有蛋白質存在；后者各加納氏試劑1滴，出現顏色反應者存在NH₄⁺。將檢查結果用“-，+，++”等符號記錄于下表中。選取蛋白含量高且不含銨離子的樣品液進行純度鑒定。

合并球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其余用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。

3. 純化  用DEAE纖維素裝柱約8~10 cm高度，并用0.0175 mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然后將脫鹽后的球蛋白溶液緩慢加于DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同上)。

4. 濃縮  經DEAE纖維素陰離于交換柱純化的γ-球蛋白液往往濃度較低。為便于鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ-球蛋白溶液2 m1，按每mL加0.2~ 0.25 g Sephadex G-25干膠，搖動2~3min，3000 r/min離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。

5. 鑒定  取醋酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽后的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點上。然后參閱“實驗方案一”進行電泳分離、染色。比較電泳結果。

【實驗注意事項】

1. 凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩(wěn)定，分離效果好。

2. 層析柱柱床應裝均勻，進樣及洗脫時切勿使床面暴露在空氣中，加樣時必須均勻，切勿攪動床面，否則均會影響分離效果。

3. 本法是利用γ-球蛋白的等電點與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。

4. 離子交換劑的再生和保存：離子交換劑的價格較貴，每次用后只需再生處理便能反復使用多次。處理方法是：交替用酸、堿處理，最后用水洗至接近中性。陽離子交換劑最后為Na⁺型，陰離子以Cl^－型是最穩(wěn)定型，故陰離子交換劑處理順序為堿-水-酸-水。由于上述交換劑都是糖鏈結構。容易水解破壞，因此須避免強酸、強堿長時間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時間為3~4h。

離子交換劑容易長霉引起變質，不用時，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險品，使用時要加倍小心。

5. 除用凝膠層析法去除無機鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細的透析袋效率高，所需時間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結扎，試驗是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白質溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結扎好，即可進行透析。開始可用流動的自來水，待大部分鹽被透析出后，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，并在磁力攪拌器上進行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。

6. 濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質溶液放入較細的透析袋中，置入搪瓷盤內。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質在使用后(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風而回收；將裝有蛋白質溶液的透析袋懸掛起來，用電風扇高速吹風(10℃以下)，也可達到濃縮目的，以上兩法雖不如 SephadexG-25干膠快，但價格較便宜，方法也不煩瑣。

【思考題】

1. 血清蛋白質分為哪幾類？

2. 如何計算血清白/球蛋白比率？其臨床意義有哪些？

3. 怎樣去除樣品中的低分子鹽類？

4. 蛋白質分子為什么可以在溶液中穩(wěn)定存在？鹽析沉淀蛋白質的原理是什么？

5. 血清γ-球蛋白的分離純化采用了哪些分離純化方法？這些方法的原理分別是什么？

6. 層析操作過程中有哪些注意事項？