三、補體法
1．直接檢查組織內(nèi)免疫復合物法 用抗補體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原抗體補體復合物---抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。
圖3-4 補體法
2．間接檢查組織內(nèi)抗原法 常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應，補體就結(jié)合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應，形成抗原抗體—抗補體熒光抗體的復合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標記顯示。
四、雙重免疫熒光標記法
在同一細胞組織標本上需要同時檢查兩種抗原時，要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B)以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。
五、對照試驗
為了保證免疫熒光細胞化學染色的準確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗時進行以上對照試驗：
1．直接法 需設下述對照試驗
�。�1)標本自發(fā)熒光對照：標本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光)。
�。�2)抑制試驗：可分為二步法和一步法。
①二步抑制法：標本先加未標記的特異性抗體，再加標記熒光抗體，結(jié)果應呈陰性或明顯減弱的熒光。
�、谝徊揭种品ǎ合葘晒饪贵w用未標記抗體作適量混合，再加在標本上染色，結(jié)果應為陰性。此法效果較二步法好，并且簡便。
�。�3)陽性對照：用已知陽性標本作直接法免疫熒光染色，結(jié)果應呈陽性熒光。
如對照（1)和（2)無熒光或弱熒光，（3)和待檢查標本呈強熒光即為特異性陽性熒光。
2．間接法
�。�1)自發(fā)熒光對照：同上（一)。
（2)熒光抗體對照：標本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。
（3)抑制試驗：同上。
�。�4)陽性對照：同上。
如對照（1)、（2)、（3)均呈陰性，陽性對照和待檢標本陽性則為特異性熒光。
3．補體法
�。�1)自發(fā)熒光對照
（2)熒光抗體對照
�。�3)抑制試驗
�。�4)補體對照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用標本，再用抗補體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。
�。�5)抑制試驗：標本加滅活的第一抗體，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標記的抗補體血清與抗補體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應為陰性。
�。�6)陽性對照：（1)～（5)結(jié)果陰性，（6)和待檢標本陽性時，則為特異性熒光。
