二、膠體金標(biāo)記蛋白A技術(shù)（Protein A-gold technique, PAg法)
在電鏡水平應(yīng)用較為廣泛，因該法具有特異性中、靈敏度高、方法簡便和背景染色淡等優(yōu)點。蛋白A的免疫特異性在第五章 已作了介紹，PAg復(fù)合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg 復(fù)合物與包埋劑和細(xì)胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結(jié)合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復(fù)合物分子最小易于穿透組織。
1．蛋白A—金（PAg)復(fù)合物的制備（Slot 和Geuze,1981)
（1)膠體金液的制備，應(yīng)用枸椽酸三鈉還原法（見第五章 )。
�。�2)待標(biāo)記蛋白質(zhì)和金溶液的準(zhǔn)備，同前。注意點是用0.2mol/l K2CO3將金溶液pH調(diào)至5.9～6.2之間。
（3)確定膠體金與蛋白A的結(jié)合用量比例。取一系列盛有0.1ml膠體金液的小玻璃管，分別加入不同量的蛋白A，5min后，再各加0.25ml 10%的NaCl。如加入的蛋白A濃度不夠，不能穩(wěn)住金粒，在電解質(zhì)NaCl的影響下，金粒聚合沉淀，溶液由紅變藍(lán)。選擇能防止溶液由紅變藍(lán)的最低濃度的蛋白A的量作為兩者的結(jié)合比例。以枸椽酸鈉法制成的膠體金每毫升約需要5μg蛋白A來結(jié)合，方能保證其穩(wěn)定性。醫(yī)學(xué)全在.線提供
�。�4)膠體金與蛋白A的結(jié)合和純化，依上法測得所需的比例超過10%，即每30ml膠體中加入2mg蛋白A，5min后，加入0.3ml PEG作為穩(wěn)定劑，然后以15000r/min離心45min（不同方法制備的金離心速度不同)，略帶紅色的松散的復(fù)合物沉淀即為PAg復(fù)合物。小心棄去上清液，加入PBS沖洗，如上，松散的PAg復(fù)合物置于PBS溶液中，按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作為穩(wěn)定劑，保存于硅化的玻璃器皿中備用，也有主張將上述PAg復(fù)合物放入3～6ml 5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%疊氮鈉混合液中，再離心，棄去無色上清液后，收取管底部濃縮純化的PAg復(fù)合物置4℃保存。
據(jù)文獻(xiàn)報告，此PAg復(fù)合物的原液在4℃可保存達(dá)一年之久。
2．電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術(shù)的應(yīng)用原則是二步標(biāo)記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白—PBs （pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液（pH7.4)來封閉非特異性的結(jié)合部位，而不是采用羊或其它的動物的正�？寡澹驗镻Ag復(fù)合物能夠與正常血清組中的Ig結(jié)合，從而給出假陽性結(jié)果；②在應(yīng)用第一抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復(fù)合物孵育前的準(zhǔn)備時，應(yīng)用的PBS或TBS的pH應(yīng)變更為pH7.4。在變更這兩步后，其它可參照本節(jié) 中包埋前、后染色法進(jìn)行。也可采用下列步驟進(jìn)行包埋后染色。
（1)載有超薄片的鎳網(wǎng)或金網(wǎng)浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上，室溫約5min。
�。�2)載網(wǎng)不沖洗，直接移至第一抗血清液滴上，在室溫孵育2h或4℃18～24h。
�。�3)PBS沖洗3min×2次。
�。�4)將PAg原液稀釋10～20倍，載網(wǎng)浮于該液滴上，室溫孵育1h。
�。�5)PBS沖洗5min×2次。
�。�6)5%醋酸鈾水溶液染色，水洗。
�。�7)枸椽柄鉛染色。
�。�8)電鏡觀察。
