（2)免疫應(yīng)用的熒光染料及染色：免疫應(yīng)用中的熒光染料主要有FITC（488nm)、TRITC（515nm)、PE（藻紅蛋白，575nm)及其組合。在進(jìn)行多種標(biāo)記時(shí)特別要注意結(jié)合抗體的每種色素都不干擾抗體反應(yīng)的特異性，也不相互干擾。
免疫熒光染色有直接法和間接法二類：
�、僦苯尤旧�
1)取約106的細(xì)胞置于尖底離心管內(nèi)，管內(nèi)液體要少些。加熒光標(biāo)記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標(biāo)記染色也可直接加入。
2)用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4)離心清洗細(xì)胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。
3)加入適量緩沖液待測(cè)。
②間接染色法：
1)取106細(xì)胞加特異的第一抗體，4℃溫度下靜置15～30min。
2)加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，4℃靜置30 min。
3)緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測(cè)。為減少無(wú)關(guān)因素干擾，操作盡量在水浴中進(jìn)行。
染色中應(yīng)注意的事項(xiàng)：①細(xì)胞標(biāo)本在整個(gè)過(guò)程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細(xì)胞死亡；②熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用濾膜或高速離心去除顆�；虺猎詼p少非特異性干擾；③細(xì)胞標(biāo)本染色前應(yīng)除死細(xì)胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。
�。�3)免疫熒光標(biāo)本的特殊處理：
�、偎兰�(xì)胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細(xì)胞及碎片，影響分析結(jié)果。對(duì)于血細(xì)胞可用FCM通過(guò)0。散射的差異不經(jīng)染色而將死細(xì)胞分出棄除；對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，由于其大小分布不均，可在樣品內(nèi)加少量PI染色后將死細(xì)胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。
�、跇�(biāo)本的保存和固定：實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)樣品在染色或分析前需要保存一定的時(shí)間，有時(shí)甚至需要進(jìn)行固定。
未染色的新鮮標(biāo)本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×106～1×107細(xì)胞在-70℃過(guò)夜，然后置液氮中可長(zhǎng)期保存。
免疫染色未經(jīng)固定的標(biāo)本在4℃可保存48h。若需存放時(shí)間較長(zhǎng)、或標(biāo)本具有傳染性，應(yīng)該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經(jīng)免疫熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4℃溫度保存。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)固定處理的標(biāo)本保存1周至2個(gè)月，多數(shù)樣品的陽(yáng)性細(xì)胞群體比例及熒光強(qiáng)度增色能保持在正常范圍之內(nèi)。
�。�4)主要檢測(cè)的免疫指標(biāo)：
�、偌�(xì)胞毒試驗(yàn)：細(xì)胞毒是機(jī)體的一種免疫監(jiān)督機(jī)制，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)重要的免疫指標(biāo)。例如天然殺傷細(xì)胞NK（Natural killer)是一種引起免疫媒介的效應(yīng)物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對(duì)NK細(xì)胞的測(cè)量可以做為免疫治療監(jiān)測(cè)的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指標(biāo)。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate)。
�、谕淌晒δ軐�(shí)驗(yàn)：?jiǎn)魏送淌杉?xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體的主要防御系統(tǒng)之一。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細(xì)胞的吞噬能力和速度。
③I型變變態(tài)反應(yīng)的IgE受體細(xì)胞、IgE結(jié)合因子的檢查。
�、馨麧{Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測(cè)定，等等。
3．在臨床方面的應(yīng)用FCM在臨床診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后預(yù)測(cè)等方面都發(fā)揮了一定的作用。工作做得較多的主要在腫瘤學(xué)、血液病學(xué)等。這些都和FCM在熒光細(xì)胞化學(xué)中的直接應(yīng)用有關(guān)。醫(yī).學(xué) 全,在.線,提供www.med126.com
�。�1)癌前病變的檢測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)：有效地發(fā)現(xiàn)癌前病變而給予阻斷治療，無(wú)疑是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié) 。FCM的探測(cè)對(duì)象主要是癌前細(xì)胞，即那些處于正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的量變階段、尚未達(dá)到質(zhì)變的細(xì)胞。研究表明，除心肌、肝組織及精子細(xì)胞外，人類正常的體細(xì)胞都具有恒定的DNA二倍體含量，而那些癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞則在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴有DNA含量變化異常。另在資料表明：癌前病變向癌變的轉(zhuǎn)化發(fā)生率與細(xì)胞的不典型增生程度有關(guān)，而細(xì)胞的不典型增生程度又與DNA含量的異常改變呈平行關(guān)系。利用FCM可以定量地測(cè)出癌前細(xì)胞的DNA含量并根據(jù)DNA分布直方圖直觀地反映出細(xì)胞的周期分布狀態(tài)，從而了解到癌前細(xì)胞增殖能力變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這樣便可以獲得一些從組織形態(tài)學(xué)中難以得到的信息。
表10-1 是以胃粘膜為例比較正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞在DNA含量及細(xì)胞周期分布方面的差異。
表10-1 正常與胃癌的胃粘膜細(xì)胞DNA含量方面的差異
| 二倍體 | DNA含量（%) | 細(xì)胞周期分布（x±s) | |||
| 非整倍體 | G0/G1 | S期 | G2/M期 | ||
| 正常細(xì)胞 | 100 | 0 | 88.9±1.2 | 5.0±0.6 | 3.4±0.7 |
| 胃癌患者細(xì)胞 | 0 | 100 | 77.3±1.8 | 10.9±1.1 | 7.4±0.7 |
從表中看出差異是顯著的。我國(guó)一些學(xué)者也提出有關(guān)FCM診斷癌腫細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，并已付之臨床應(yīng)用。
目前，對(duì)于癌癥病人預(yù)后評(píng)估的主要依據(jù)是病理組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等指標(biāo)，不少人已認(rèn)識(shí)到用FCM來(lái)檢測(cè)DNA是對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的一個(gè)較為客觀有效的指標(biāo)�？偟膬A向是：異倍體的出現(xiàn)是惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志；異倍體腫瘤的惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高及死亡率高；二倍體及近二倍體腫瘤預(yù)后較好。
在臨床血液學(xué)方面的應(yīng)用目前也以血液系統(tǒng)的腫瘤診斷、分型和預(yù)后關(guān)系等方面的應(yīng)用為主；其主要技術(shù)途徑也是基于對(duì)DNA倍體分析和細(xì)胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多敘。有關(guān)的技術(shù)細(xì)節(jié) 將在下節(jié) 以FCM在外周血白細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析方面的應(yīng)用為例詳加介紹。
�。�2)DNA指數(shù)：由于DNA的非整倍體細(xì)胞是腫瘤的特異性標(biāo)志已經(jīng)得到腫瘤學(xué)界的公認(rèn)，在些學(xué)者提出建議采用流式細(xì)胞術(shù)DNA分級(jí)指數(shù)（Flow cytometry DNA Crading Index, 簡(jiǎn)稱DNA指數(shù)或DI)表示DNA含量的異常程度。根據(jù)1984年國(guó)際分析細(xì)胞學(xué)會(huì)名詞審定委員會(huì)的規(guī)定：
一般樣品應(yīng)采用同種或同個(gè)體的正常細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。在血液學(xué)研究中通常以正常人外周血淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。需要指出的是，在報(bào)告DNA的測(cè)定結(jié)果時(shí)必需包括G0/G1峰的變異和系數(shù)，即C.V值，若有多個(gè)DNA干系則要給出各個(gè)G0/G1峰的C.V值。用于腫瘤臨床診斷的總體依據(jù)是：a.正常二倍體的DI=1.0，判斷為陰性；b.出現(xiàn)二個(gè)或多個(gè)可以分辨的G0/G1峰則可判斷為陽(yáng)性；c.雖無(wú)明顯的G0/G1峰的分化現(xiàn)象，但峰的C.V值較大，則可根據(jù)DI數(shù)個(gè)及其它有鑒別意義的征狀給出參考性的診斷。
以上我們主要從FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的基本原理和技術(shù)途徑介紹了和組織化學(xué)有關(guān)的內(nèi)容，至于一些技術(shù)細(xì)節(jié) 則在下節(jié) 做較為詳細(xì)的說(shuō)明。
