流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床腫瘤學(xué)、臨床血液學(xué)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。本節(jié) 概要介紹它們的技術(shù)途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細(xì)胞化學(xué)密切相關(guān)的。
一、FCM應(yīng)用的技術(shù)途徑
FCM是通過測量細(xì)胞的多種參量來獲取信息的。細(xì)胞參數(shù)分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量兩大類。結(jié)構(gòu)參量主要用于描述細(xì)胞的化學(xué)組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細(xì)胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經(jīng)熒光標(biāo)記方可測定，有的并不需要熒光標(biāo)記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內(nèi)pH值和細(xì)胞大小等為結(jié)構(gòu)參數(shù)；細(xì)胞周期動力學(xué)、特殊配體的鑒定、特殊細(xì)胞的生物活性等則為功能參數(shù)。
1．DNA和RNA的測量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標(biāo)記后測出。對細(xì)胞內(nèi)DNA含量的測定可用于細(xì)胞生物學(xué)方面的研究和臨床腫瘤學(xué)的診斷；測量RNA的含量可用于血液中的網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測和計(jì)數(shù)；DNA和RNA含量的測定可以用于區(qū)別細(xì)胞周期中的G0和G1期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange)、派洛寧Y（PY，Pyronine Y)、HO（Hoechst)系列和色霉素A3（CA3)等。利用HO/CA3雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結(jié)合Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷)單克隆抗體免疫熒光來測定細(xì)胞內(nèi)DNA合成。
2．蛋白質(zhì)總量測定用FCM可以測定細(xì)胞中蛋白的總含量，以檢測一個(gè)細(xì)胞群體生長和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細(xì)胞亞群，如血液中的白細(xì)胞的分類。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，F(xiàn)luorescein isothiocyanate)，F(xiàn)ITC以共價(jià)鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結(jié)合。
3．特殊配體的測定配體是與不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異結(jié)合很強(qiáng)的各種大分子和小分子，通過對特異性的熒光標(biāo)記的配體的測定可以獲得不少有關(guān)結(jié)構(gòu)參量和功能參量的信息。例如用標(biāo)記的外源凝集素可檢測細(xì)胞表面糖；用標(biāo)記抗體可測表面抗原；用標(biāo)記多聚陽離子可檢測細(xì)胞表面電荷；用標(biāo)記的激素、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒等可檢測細(xì)胞受體；用標(biāo)記的大分子、微生物等可檢測細(xì)胞的內(nèi)吞性；用熒光素標(biāo)記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細(xì)胞的DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因等。這方面的應(yīng)用范圍廣、有前途，已經(jīng)成為研究細(xì)胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的強(qiáng)有力的新技術(shù)。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國德州紅等)、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。
4．生物活性的測定就生物流行性來說，主要包括兩方面工作：①細(xì)胞本身的死活；②活細(xì)胞生物功能發(fā)揮的強(qiáng)弱。前項(xiàng)工作單一，后項(xiàng)工作要復(fù)雜得多。FCM用來判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate)它可被活細(xì)胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細(xì)胞有損傷則會從細(xì)胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細(xì)胞膜，但能對固定的細(xì)胞及膜有破損的細(xì)胞的核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide)和溴化乙錠（EB,Ethidium bromide )就是常用的第二類熒光探針。
用FCM來測定活細(xì)胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標(biāo)很多。例如可用來測細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞內(nèi)鈣等，這些都和細(xì)胞的激活密切相關(guān)。FCM也可用來測膜結(jié)構(gòu)的流動性或微粘度等。有報(bào)告可以用FCM代替51Cr的放射免疫分析來測定天然殺傷細(xì)胞（NK, Natu-ral killer cells)對靶細(xì)胞毒理學(xué)活性的大小。
二、FCM的典型應(yīng)用簡介
下面簡單介紹FCM在各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用的典型實(shí)例，以求對FCM應(yīng)用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的背景。
1．在細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)是FCM應(yīng)用最廣泛也是最基本的領(lǐng)域，細(xì)胞周期分析是其基本分析內(nèi)容之一，而實(shí)施的技術(shù)途徑是通過測定細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量來達(dá)到的。
眾所周知，細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期所構(gòu)成的。各期細(xì)胞的DNA含量如下：G1期為2C，G2期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G1峰的道數(shù)恰好是G2和M峰道數(shù)的一半（圖10-7)。研究表明：對于正常細(xì)胞群，各周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù)的比例是同一的；對于惡性病變的細(xì)胞群則是非均一的（圖10-8)。
圖10-7 細(xì)胞周期的DNA直方圖
圖10-8 細(xì)胞周期中的細(xì)胞數(shù)目與腫瘤的關(guān)系
臨床腫瘤病學(xué)已經(jīng)注意到細(xì)胞動力學(xué)的重要性。研究工作表明：腫瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感程度與細(xì)胞的增生率高低密切相關(guān)；采取細(xì)胞同步化（Cell Synchronization)措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽性的乳腺癌細(xì)胞同步化。
臨床微生物學(xué)可以用FCM對大量細(xì)菌的DNA和RNA含量進(jìn)行測量，進(jìn)行微生物鑒定、醫(yī)學(xué)常規(guī)中的細(xì)菌抗生素敏感試驗(yàn)和傳染活性的測定。
FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域也能充分發(fā)揮。例如流式細(xì)胞核型分析技術(shù)就是用FCM對染色體進(jìn)行分類、純化，檢測或定量測量細(xì)胞表面或內(nèi)部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預(yù)選擇，以及對人類計(jì)劃生育等方面的工作。
2．在免疫學(xué)方面的應(yīng)用 FCM以它的快速、靈活及定量的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個(gè)方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分�；诿庖呒夹g(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問題。
�。�1)免疫應(yīng)用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術(shù)的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線最強(qiáng)。為了擴(kuò)大儀器對雙標(biāo)記或三標(biāo)記染色的熒光信號的分辨范圍可使用雙激光光源。
為了減少細(xì)胞由于激光束造成的散射光對光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時(shí)測定兩種波長以上的熒光信號，光路中還要使用二向性分光元件。
為了測定伴隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程所產(chǎn)生的早期免疫及生化性質(zhì)的改變，例如膜的流行性，DNA構(gòu)象變化等，可以使用偏振片。
總之，應(yīng)用于免疫學(xué)時(shí)要充分考慮有關(guān)光源及光學(xué)濾片系統(tǒng)的正確使用。
