八、光敏2，4-二硝基苯（光敏DNP)標(biāo)記DNA法
光敏DNP由一連接臂組成，一端是2，4-二硝基苯，另一端有芳基疊氮化合物。此法適用于含氨基檢測基團。其敏感性和光敏生物素標(biāo)記探針相同，檢測時需要抗DNP抗體和免疫化學(xué)顯色。標(biāo)記方法：（1)DNA不心變性，必須溶于水中，取2～10μg10μl，加入二甲亞砜25μl，每微克DNA加入光敏DNp 2μg（在避光條件下)，混勻。（2)置入冰浴中，在特制燈10cm下照射10min。（3)加入水165μl，4mol/L醋酸鈉20μl和異丙醇50μl，混勻。（4)用705和無水乙醇沉淀各一次，晾干，按50μg/ml溶于200μl水中，如探針不溶時，可在60℃水溶中加熱10min，離心5min，除去不溶性雜質(zhì)，分裝，-20℃可保存1～2年。此法簡便，不僅適用于核酸標(biāo)記，也適用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。
九、三硝基苯磺酸（TNBS)標(biāo)記核酸探針
在溫和的條件下，TNBS將核酸的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N-甲氧基-5，6-二氫嘧啶-6-磺酸鹽衍生物，對胞嘧啶殘基進行磺化修飾制成磺化半抗原探針。此法十分簡便，也可用于蛋白質(zhì)的標(biāo)記。標(biāo)記方法：取變性單鏈的DNA5μg，溶于0.02mol/L硼酸鈉緩沖液（pH8.6)中，加入TNBS5μg溶解，在室溫中反應(yīng)1h。移入冰浴中，加入無水乙醇和70%乙醇各洗1次，晾干，用50μl消毒雙蒸水溶解，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>
十、生物素化的RNA探針標(biāo)記
RNA探針比cDNA探針的敏感性提高10倍以上，在許多優(yōu)點。它們是單鏈，不需變性，也沒有互補鏈的干擾，與靶基因雜交比DNA探針更穩(wěn)定。Bio-11-dUTP可通過Sp6、T3和T7RNA聚合酶摻入到RNA轉(zhuǎn)錄子中。標(biāo)記方法：其下列反應(yīng)體積為50μl：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl2、2mmol/L亞精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/L每一ATP、GTP、GTP，1mmol/L生物素Bio-11-Dutp,500ng模板，45u T3RNA聚合酶�；旌希�37℃反應(yīng)1h。加入10%SDS終止反應(yīng)。凝膠過濾分離標(biāo)記RNA探針。
十一、辣根過氧化物酶標(biāo)記核酸探針法
此法標(biāo)記原理如下圖所示：
標(biāo)記的HRP部分催化底物化學(xué)發(fā)光反應(yīng)：氨基苯二甲酰肼
氨基苯二甲酸
+N2+光→X-光片上感光10～20min顯定影。
光亮子在酚、萘及胺類等增強劑促進下，而使光亮增強。
這種方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽芊懦�，稱為化學(xué)發(fā)光。雜交后與探針結(jié)合的酶催化相應(yīng)的發(fā)光劑，經(jīng)增強劑將光能放大，在X光片上顯示雜交信號。此方法靈敏度與同位素標(biāo)記水平相當(dāng)，簡便快速，安全，是一種特異性好的檢測手段，具有廣泛的應(yīng)用前景。
HBV-DNA的HRP標(biāo)記方法：質(zhì)粒中插入HBV全基因組DNA，長3.2kb，載體為PBR322質(zhì)粒，4.3kb。將質(zhì)粒DNA用三蒸水稀釋成10ng/μl，取20μl放入EP管，100℃變性5min，加入20u HRP標(biāo)記試劑，混勻，加入戊二醛20μl混勻，37℃10min，此時可立即使用，或放在冰浴中10～15min內(nèi)使用，或加入50%去離子甘油-20℃保存供分子雜交用，可存放6個月。
十二、用聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記高活性DNA探針
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或稱體外基因倍增技術(shù)，它利用一對位于待擴增的DNA序列兩端的取向相對的DNA引物，在DNA聚合酶的介導(dǎo)下，經(jīng)過多次變性，退火和延伸過程的重復(fù)性循環(huán)，大量合成靶DNA序列。在標(biāo)記dNTP存在時，經(jīng)PCR反應(yīng)產(chǎn)生的靶DNA片段均參入了標(biāo)記物，用此法標(biāo)記的探針標(biāo)記率高達97.4%。此法重復(fù)性好，簡便、快速、特異、不要求模板DNA的純度，可以大量制備。此法有普遍應(yīng)用價值。
標(biāo)記方法如下：待標(biāo)DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2 dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L，明膠200μg/ml，2u Taq DAN聚合酶，總反應(yīng)體積為100μl�；靹蚝螅邮炗头忭�，94℃和55℃各2min，72℃3min，經(jīng)25個循環(huán)后，可產(chǎn)生5～10μg標(biāo)記探針，需時僅4h。乙醇沉淀擴增的產(chǎn)物后，溶于100μl TE中，分裝-20℃。
