放射性標記核酸探針在使用中的限制，促使非放射性標記核酸探針的研制迅速發(fā)展，在許多方面已代替放射性標記，推動分子雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前已形成兩大類非放射標記核酸技術(shù)，即酶促反應(yīng)標記法和化學修飾標記法。
酶促反應(yīng)標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸如生物素-11-dUTP摻入到探針DNA中，制成標記探針，敏感度高于化學修飾法，但操作程序復雜，產(chǎn)量低，成本高。
化學修飾法是將不同標記物用化學方法連接到DNA分子上，方法簡單，成本低，適用于大量制備（>50μg)如光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照10～20min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上。
非放射性標記核酸探針方法很多，現(xiàn)介紹常用的幾種方法如下：
一、生物素標記核酸探針方法
生物素標記的核苷酸是最廣泛使用的一種，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾標記法。實驗發(fā)現(xiàn)生物素可共價連接在嘧啶環(huán)的5位上，合成TTP或UTP的類似物。在離體條件下，這種生物素化dUTP可作為大腸桿菌多聚酶I（DNA酶I)的底物摻入帶有缺口的DNA或RNA，得到生物素標記的核酸探針。這種標記方法稱為缺口平移法。用標記在DNA上的生物素與鏈霉親合素-酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶)標記物進行檢測。醫(yī)學全.在.線f1411.cn
缺口平移法標記生物素DNA探針：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中)加下列反應(yīng)液：
待標記DNA 0.1μg/μl 5μl
10×NTB 1μl
DNase I 2pg/μl 1μl
消毒三蒸水 3μl 總體積達10μl
混勻，37℃，15min。離心10000r/min 1min后，放入冰浴中，繼續(xù)加入下列反應(yīng)液：
dNTP(ACG)0.5μg/ml 2μl
Bio –11 –dUTP 0.5μg/ml 2μl
10×NTb 4μl
消毒三蒸水 31μl
混勻，短暫離心后，加入
DNA聚合酶I（5u/μl)1μl 總體積50μl
混勻，14℃過夜（10h以上)，加入
終止液 2μl
經(jīng)Sephadex –G –50柱分離，回收生物素標記DNA。
10×NTB配法：500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl2；80mmol/L β-巰基乙醇，500μg/ml BSA。
終止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –HCl (pH7.5)。
缺口平移法標記探針少量多次標記效果較好，即每次標記DNA不超過1μ.Bio –11-dUTP要濃貯，分裝，-20。C保存，反復凍融常會降解失活。Bio –11- dUTP貯存液：10mmol/L即100μg Bio-11-dUTP中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀釋液，分裝成3μl/支，-20℃保存。
地高辛-dUTP標記DNA也可按此法進行。
乙醇沉淀分離回收標記DNA比較方便，即加入5μl4mmol/l LiCl,125μl冷乙醇，混勻，-20℃放置30min,12000r/min離心5min，去上清，用70%乙醇和無水乙醇洗沉淀物，倒置離心管，晾干，用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物（0.1μg/μl)-20。C保存。用LiCl 可較好地分離DNA和可溶性核苷酸，因為dNTPS的鋰鹽在乙醇中比鈉鹽溶解性更大。
二、光敏生物素標記核酸探針
光敏生物素有一個連接臂，一端連接生物素，另一端有芳基疊氮化合物。在可見光照射下，芳基疊氮化合物可能變成活化芳基硝基苯，很易與DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特異結(jié)合，大約每50個堿基結(jié)合一個生物素，所以只用于標記大于200個核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸鹽很易溶于水，與核酸形成的共價結(jié)合很穩(wěn)定。此法有以下優(yōu)點：方法簡便易行，快速省時，不需昂貴的酶和dUTP等；只需光照，探針穩(wěn)定，-20℃可保存12個月以上。適用于DNA和RNA，抗體和酶等的標記。在原位分子雜交，斑點雜交和Southern印跡雜交中應(yīng)用，其特異性和靈敏性較高，價廉易購，國內(nèi)已有試劑盒供應(yīng)，軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所馬立人教授等研制和生產(chǎn)的光敏生物素核酸探針和檢測試劑盒使用良好。
方法步驟：在一滅菌Eppendorf管中加待標記DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混勻，插入冰浴中，置特制光源下10cm處照射20min。加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA 10μl混勻。再加入等體積仲丁醇，混勻。離心1min（10000r/min)吸去上層仲丁醇，棄去。再加入仲丁醇25μl，重復提取游離的光敏生物素。吸去上層無色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸鈉，充分混勻，加入冷無水酒精100μl充分混勻，沉淀標記DNA，置-20℃過夜（或-70℃15min)15000r/min離心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，離心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，測定探針濃度，分裝，保存于-20℃。
