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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 人體寄生蟲(chóng)學(xué) > 正文:寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)
    

寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù):病原檢查及免疫論斷及新技術(shù)應(yīng)用

 

 。ㄎ)免疫熒光法

  免疫熒光法(immunofluorescent method,IF)是借抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異熒光染色的診斷技術(shù)。最常用的熒光素為異硫氰基熒光素(fluorescein  isothiocynate,F(xiàn)ITC)。常用于寄生蟲(chóng)感染的熒光抗體染色有直接法與間接法。

  1.直接法 用于檢測(cè)抗原,其缺點(diǎn)是每查一種抗原必須制備與其相應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體。目前很少應(yīng)用。
2.間接法 也稱間接熒光抗體法(indirect fluorescent antibody  method,IFA)。將抗原與未標(biāo)記的特異性抗體(如患者血清)結(jié)合,然后使之與熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體(抗抗體)結(jié)合,三者的復(fù)合物可發(fā)出熒光。本法的優(yōu)點(diǎn)是制備一種熒光標(biāo)記的抗體,可以用于多種抗原,抗體系統(tǒng)的檢查,即可用以測(cè)定抗原,也可用來(lái)測(cè)定抗體。IFA的抗原可用蟲(chóng)體或含蟲(chóng)體的組織切片或涂片,經(jīng)充分干燥后低溫長(zhǎng)期保存?zhèn)溆。一張載片可等距置放多個(gè)抗原位點(diǎn)用以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本或確定滴度。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

  IFA的操作步驟如下:①抗原標(biāo)本:用記號(hào)筆或蠟筆將各個(gè)抗原位點(diǎn)圍圈隔離;②在每個(gè)抗原位置滴加已稀釋的血清樣本或樣本稀釋系列,使樣本液充滿圈內(nèi),置濕匣37℃孵育30分鐘;③用pH8.00.01mol/L PBS沖后再置同樣PBS液中浸泡5分鐘,不時(shí)搖動(dòng),如此2遍,然后取出吹干;④在抗原位點(diǎn)滴加經(jīng)pH8.0PBS適當(dāng)稀釋的羊抗人IgG熒光抗體(每批結(jié)合物的工作濃度需經(jīng)滴定),使完全覆蓋抗原膜,置濕盒37℃孵育30分鐘;⑤經(jīng)洗滌(同③)后用0.1‰伊文思藍(lán)液復(fù)染10分鐘,然后以PBS流水沖洗0.5~1分鐘,風(fēng)干;⑥用pH8.5或pH8.0碳酸(或磷酸)緩沖甘油封片,也可加一小滴PBS(pH8.0)覆以蓋片鏡檢。鏡檢應(yīng)及時(shí)進(jìn)行以免疫光衰變。可使用熒光光源或輕便熒光光源,配以適合的激發(fā)濾片和吸收濾片,在低倍或高倍鏡下檢查。以見(jiàn)有符合被檢物形態(tài)結(jié)構(gòu)的黃綠色清晰熒光發(fā)適合的激發(fā)濾片和吸收濾片,在低倍或高倍鏡下檢查。以見(jiàn)有符合被檢物形態(tài)結(jié)構(gòu)的黃綠色清晰熒光發(fā)光體、而陰性對(duì)照不可見(jiàn)者為陽(yáng)性反應(yīng)。根據(jù)熒光亮度及被檢物形態(tài)輪廓的清晰度把反應(yīng)強(qiáng)度按5級(jí)區(qū)別(+++,++,+,±,-)。+以上的熒光強(qiáng)度為陽(yáng)性。

  該法具有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性,應(yīng)用抗原經(jīng)濟(jì)。國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷方法,血清流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)疫情的方法,如主要用于診斷瘧疾、絲蟲(chóng)病及血吸蟲(chóng)病,也有用于肺吸蟲(chóng)病、華支睪吸蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病及弓形蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷。

  近10年來(lái),國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)IFA進(jìn)行了很多改進(jìn)。李允鶴等(1984,1988)通過(guò)深入研究,確定了感染鼠肝細(xì)胞內(nèi)蟲(chóng)卵冰凍切片為IFA較為理想的診斷抗原。該法需用熒光顯微鏡判斷結(jié)果,限制了它的應(yīng)用范圍。但是應(yīng)用該法時(shí)必須具備的熒光抗體,目前國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng),這為IFA的擴(kuò)大應(yīng)用,提供了條件。

  (六)對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)

  對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)(counter-immunao electrophoretic  assay,CIE)以瓊脂或瓊脂糖凝膠為基質(zhì)的一種快速,敏感的電泳技術(shù)。

  對(duì)流電泳較簡(jiǎn)單的擴(kuò)散法和常規(guī)免疫電泳法至少敏感10~20倍,省時(shí),省料,可用已知抗原檢測(cè)抗體或相反,反應(yīng)結(jié)果特異,陽(yáng)性反應(yīng)的可信度高,適用范圍廣。近年來(lái)本法的改進(jìn)已試用酶或放射標(biāo)記的反應(yīng)配體,如酶標(biāo)記抗原對(duì)流免疫電泳(ELACIE)、放射對(duì)流免疫電泳自顯影術(shù)(RCIEA)等。以克服電泳技術(shù)本身不夠靈敏的弱點(diǎn),國(guó)內(nèi)在血吸蟲(chóng)病、肺吸蟲(chóng)病免疫診斷已獲良好結(jié)果。國(guó)外報(bào)道應(yīng)用于阿米巴病、錐蟲(chóng)病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸蟲(chóng)病等血清學(xué)診斷。

  (七)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

  酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay.ELISA)簡(jiǎn)稱酶聯(lián)試驗(yàn),已廣泛用于多種寄生蟲(chóng)感染的宿主體液(血清,腦脊液等)以及排泄分泌物(尿,乳,糞便等)內(nèi)特異抗體或抗原微粒的檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)要求,試驗(yàn)可分多種類型,常用者有:用于檢測(cè)抗體的間接法;檢測(cè)IgM的雙夾心法;檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法;以固相抗體檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法以及競(jìng)爭(zhēng)抑制法等(圖21-8)。

圖21-8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)常用方法示意圖

  酶聯(lián)試驗(yàn)的方法根據(jù)所用載體、酶底物系統(tǒng)、觀察反應(yīng)結(jié)果等不同而有很大差別。目前最常用的固相載體為聚苯乙稀微量滴定板,具有需樣少,敏感,重演性好,使用方便等優(yōu)點(diǎn)。酶底物系統(tǒng)也有多種,常用的有辣根過(guò)氧化物酶-鄰苯二胺(HRP-OPD)、堿性磷酸酯酶-硝酚磷酸鹽(AKP-PNP)等,具有較好的生物放大效應(yīng)。其中HRP由于價(jià)廉、易得而被廣泛應(yīng)用。

  酶聯(lián)試驗(yàn)的基本操作過(guò)程可分為:①固相包被;②溫育洗滌;③加樣;④酶結(jié)合物反應(yīng);⑤底物顯色;⑥終止反應(yīng)讀取結(jié)果等若干步驟。溫育和洗滌需貫穿在每二步驟之間,用以去除多余的反應(yīng)物。以下為臨床上最常用的間接法(檢測(cè)抗體)和雙抗體夾心法(檢測(cè)抗原)的操作程序:

 、砰g接法:

  1)以包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液0.05mol/L,pH9.6)稀釋抗原(常用5~10µg/ml),每孔0.1(或0.2)ml包被反應(yīng)板,37℃濕盒溫育2~3小時(shí)或4℃過(guò)夜;
2)棄去包被液,反應(yīng)板用去離子水或PBS-Tween液(0.005mol/L PBS含0.05%Tween-20)沖洗3次,甩干;
3)用樣本稀釋液(0.05mol/L PBS含0.05%Tween-20)稀釋樣本(起始濃度≥100-1),用樣本稀釋液(每孔0.1(或0.2)ml,溫育1小時(shí);
4)棄去樣液,如上沖洗,甩干加稀釋結(jié)合物(市售品常稀釋至100-1,用樣本稀釋液),每孔0.1(或0.2)ml,溫育1~2小時(shí);
5)如上沖洗甩干后即刻加入新鮮配制的底物系統(tǒng),每孔0.1(或0.2)ml,置暗盒室溫15分鐘;
6)終止反應(yīng):HRP-OPD系統(tǒng)每孔加1mol/LH2SO450µl;
7)目測(cè)或用分光光度計(jì)在400µm波段測(cè)定吸收值來(lái)判斷。

 、齐p抗體夾心法:

  1)以包被液稀釋抗體(如兔抗血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵可溶性抗原的抗體,抗SEA-IgG)包被反應(yīng)板(1~1000µg/ml),方法同間接法包被抗原;
2)沖洗,甩干,加樣溫育同前(起始濃度≥5-1);
3)加結(jié)合物(例如抗SEA-IgG-HRP),適宜工作濃度需先經(jīng)方陣滴定確定;
4)以下各步同間接法。

  若包被抗體與第二抗體來(lái)自不同種的供體則可應(yīng)用市售抗免疫球蛋白結(jié)合物。例如包被抗體為羊抗SEA,二抗用兔抗SEA則在未標(biāo)記的二抗溫育洗滌后加羊抗兔IgG結(jié)合物(GAP-HRP)。

  [附]酶標(biāo)記物制備:應(yīng)用抗原或抗體與酶分子的交聯(lián)技術(shù),交聯(lián)物亦稱酶結(jié)合物(conjugate)。根據(jù)酶與抗體(抗原)的激活順序,交聯(lián)反應(yīng)可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的過(guò)碘酸鈉法多用,戊二醛一步法反應(yīng)率較低,較適用于交聯(lián)AKP。免疫球蛋白標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(過(guò)碘酸鈉法)與免疫球蛋白標(biāo)記堿性磷酸脂酶(戊二醛一步法),按常規(guī)方法制備。

  抗IgG型抗體酶結(jié)合物也可用金黃色葡萄球菌A-蛋白酶結(jié)合物替代,稱A-蛋白酶聯(lián)試驗(yàn)(SPA-ELISA)。A-蛋白辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物(PA-HRP)已有市售標(biāo)準(zhǔn)品,其敏感度稍遜于抗體酶結(jié)合物。

  底物配制:不同的酶要求選擇相應(yīng)底物,以下為分別適用于比色和肉眼讀取結(jié)果的兩種HRP常用底物配制。

  鄰苯二胺(OPD):經(jīng)HRP催化后生成橘紅色產(chǎn)物。40mgOPD溶于檸檬酸磷酸緩沖液(pH5.0)100ml(含24.3ml 0.1mol/L檸檬酸,25.7ml0.02mol/L Na2HPO4加水50ml),臨用前加30%H2O20.15ml,溫育15分鐘后用2mol/l H2SO4終止反應(yīng),492nm讀數(shù)。本底物具高度敏感性,顯色梯度良好,生成可溶性產(chǎn)物,有利于比色讀數(shù),但為光敏感,反應(yīng)時(shí)應(yīng)置暗盒內(nèi);也具致突變作用。醫(yī)學(xué) 全在.線提供

  5-氨基水楊酸(5AS):經(jīng)HRP催化生成棕色產(chǎn)物。8mg5AS溶于10ml50℃溫?zé)嵴麴s水中,置4℃暗處不超過(guò)3天,臨用前以1n NaOH調(diào)pH至6.0,加0.05%H2O2 1ml。37℃經(jīng)30~60分鐘溫浴后用1n NaOH終止反應(yīng),肉眼或449nm比色。本底物無(wú)致突變作用,生成棕褐色不全溶解的產(chǎn)物有利于肉眼判讀結(jié)果。

  酶聯(lián)試驗(yàn)為高靈敏檢測(cè)技術(shù),結(jié)果可定量表示,可檢測(cè)抗體、抗原或特異性免疫復(fù)合物,微量滴定板法消耗樣本試劑少,能供全自動(dòng)操作,適用批量樣本檢測(cè),因此在寄生蟲(chóng)感染的研究和診斷領(lǐng)域乃至血清流行病學(xué)均被廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外有多種寄生蟲(chóng)感染的酶聯(lián)藥籍出售,包括有血吸蟲(chóng)病、弓形蟲(chóng)病、阿米巴病、絲蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病和犬蛔蟲(chóng)病等,ELISA可用作輔助診斷病人,血清流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)疫情的方法。酶聯(lián)試驗(yàn)操作程序的簡(jiǎn)單快速不如IHA,但方法具有很大所改良潛力和適應(yīng)范圍。判斷結(jié)果需用分光光度計(jì),限制了擴(kuò)大應(yīng)用;另外,應(yīng)用抗原及酶結(jié)合物尚需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化,操作方法也應(yīng)規(guī)范化。

  近年來(lái)已有多種改進(jìn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)如①快速-ELISA:改進(jìn)特點(diǎn)為用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反應(yīng)板作載體;將1%可溶性血吸蟲(chóng)卵抗原與尿素溶解性血吸蟲(chóng)卵抗原等量相混合預(yù)吸附于薄膜上;用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制備酶結(jié)合物;用底物TMB代替OPD。該法主要以目視法判斷結(jié)果,整個(gè)操作流程僅需20min左右。②硫酸銨沉淀抗原-ELISA:可溶性血吸蟲(chóng)卵抗原經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后用作ELISA診斷抗原;在系列實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,使操作方法達(dá)到規(guī)范化;用質(zhì)量控制圖控制檢測(cè)差異,并以標(biāo)準(zhǔn)曲線單位判斷結(jié)果;縮短檢測(cè)時(shí)間,節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,節(jié)省試液用量,提高了敏感性,特異性和重現(xiàn)性。

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