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抗血清的純化與保存-臨床醫(yī)學檢驗主任醫(yī)師2014年輔導資料

來源:本站原創(chuàng) 更新:2013-10-11 高級職稱考試論壇

抗血清的純化與保存-臨床醫(yī)學檢驗主任醫(yī)師2014年輔導資料

抗血清的純化與保存是臨床醫(yī)學檢驗主任醫(yī)師考試需要了解的知識點,醫(yī)學全在線小編搜集整理了相關資料,便于各位同學復習備考,順利通過考試!

(1)采血:加強免疫的動物2—3次后,可通過耳靜脈或眼球(小鼠)采血,進行抗血清效價測定。當效價達到理想的高度后,可以采血。采血方式可以從心臟直接取血,也可通過動脈放血。待血液凝固后用針筒或吸管吸取血清。

(2)抗血清的純化與保存:除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分醫(yī)學、教育網(wǎng)搜集整理。為了避免這些蛋白質(zhì)干擾抗體(免疫球蛋白)標記反應和抗原抗體反應,抗血清可經(jīng)過純化以獲得單一的機體(常為IgG)組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度的溶液中,其溶解度不一樣,鹽離子干擾蛋白質(zhì)和水分子間氫鍵形成,因為水—鹽結合比水—蛋白質(zhì)結合更穩(wěn)定,蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)分子越大,沉淀時所需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白(Mr1.5×105)比血清中主要蛋白質(zhì)白蛋白(Mr6.7×104)的分子大得多,抗體在30%—50%飽和度的硫酸鹽中析出,而白蛋白需在70%—80%飽和度才析出,因此常用33%飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG.鹽析時為了減少抗體變性,需在4℃進行,同時用pH8.0緩沖液稀釋抗血清,以減少蛋白濃度過高而發(fā)生共沉淀。醫(yī)。學教育網(wǎng)搜集整理銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變,0℃和25℃僅差3%,而鈉鹽則相差5倍,因此常在低溫沉淀時用銨鹽,室溫沉淀用鈉鹽。銨鹽對抗體的標記反應(如FITC和biotin標記時)有一定的干擾作用醫(yī).學.全.在.線f1411.cn。

鹽析法只能部分純化抗體,更高純度的抗體制劑可用層析法制備。IgM五聚體相對分子質(zhì)量達9.7×10,比血清中任何其他蛋白都大,用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH8.0時帶負電荷,能與DEAE纖維素上的陽離子結合,因此可用離子交換層析來純化IgG.IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性,可用這兩種蛋白質(zhì)交聯(lián)親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結合PH為8—9,洗脫PH為2—4;而與蛋白G的結合PH為5—7,洗脫PH為9—10.C蛋白更適合于IgG的純化,不但反應條件為溫和的弱酸性或弱堿性,并且與IgG的結合力高于A蛋白。G蛋自能與大部分動物種類的IgG結合,而A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結合力弱或不能結合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結合。

抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數(shù)年,反復凍融使抗體很快失活,被細菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA等可于4℃保存。長期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于50%飽和硫酸銨中4℃保存,還可以冷凍干燥保存。

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