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上海市臨床檢驗中心 胡曉波 李 冰 金大鳴 張錦鋒
隨著多數細胞計數儀的廣泛應用，結果標準化已成為主要議題。理想情況下，同一患者在不同實驗室、不同時間段、使用不同血液分析儀，同一參數的測定結果應該一致，只可能受生物學變異的影響。標準化或規(guī)范化的目的就是排除分析過程中的偏倚。
為了達到排除分析過程的偏倚，通常標準化工作包括兩個步驟：校準，即通過調整儀器排除偏倚，和質量控制，即保證儀器維持校準的穩(wěn)定性。
一、ICSH與血細胞計數標準化工作
目前，國際上關于血細胞計數的標準化工作主要由國際血液學標準化委員會（ICSH）來推動。ICSH（international council for standardization in haematology）是一個促進和鼓勵改良方法，推動建立國際間血液分析數據可比性的標準，提供專業(yè)間交流的非官方組織。
ICSH源于1963年歐洲血液學協(xié)會成立的標準化委員會，首次討論的主題是紅細胞方法學和標準化。到1966年，正式成立國際血液學標準化委員會。目前，ICSH組成了由主席、副主席、秘書長、秘書、財務負責人和干事組成的委員會，現任主席是澳大利亞的W.Hughes博士，前任主席是美國的BS.Bull教授，第一副主席是英國的A.j.Bellingham教授，第二副主席是美國的E.Simson博士，秘書長是美國的O.W.van Assendelft博士，執(zhí)行秘書是英國的R.M.Rowan博士，財務負責人是美國的B.Houwen博士，干事有來自ISLH的加拿大人B.Fernandes博士，來自WHO的英國人S.M.Lewis博士，來自ISBT的新西蘭人P.Strengers博士，和美國的J.A.Koepke博士、日本的N.Tatsumi教授。
早期ICSH有4個獨立工作組負責細胞計數方面的問題，包括細胞計數組（主席，PW Helleman），血細胞壓積（PCV）組（主席，WH Crosby）,細胞大小組（主席，JM England），和血紅蛋白測定組（主席，OW van Assendelft），由SM Lewis和JF Coster作為秘書組協(xié)調工作。階段性工作在1970年慕尼黑國際血液學委員會上作了專題報道，PW Helleman回顧了計數系統(tǒng)的物理原理，稀釋液的化學成分，和如何控制這些因素，使紅細胞計數和細胞大小測量標準化，涉及有脈沖增益、閾值、重合誤差、毛細管小孔直徑、流體動力學速率和流量、細胞通過小孔的濃度的問題。R Thom在對細胞計數小孔面積的研究中發(fā)現，細胞流經電極會影響脈沖電壓，證明通過小孔時，紅細胞會扭血成紡錘形，白細胞保持球形。SM Lewis建立了一種穩(wěn)定的、用戊二醛固定的血細胞標準物，將血液和不同動物血液（山羊、馬、人等）混合，用于核查脈沖和細胞大小分布曲線的制品，不過，因固定細胞與新鮮細胞通過檢測敏感區(qū)的方式不同，需要通過形狀因子來調節(jié)。
細胞測量組是將細胞計數、血細胞壓積、細胞大小和血紅蛋白測定組合并成立的，于1979年8月在伯林召開了第一次會議，當時主要成員有JM England(主席，已過世),RM Rowan(秘書)，OW van Assendelf,BS Bull，W Coulter(Coulter公司，已過世)，W Groner(Technicon公司)，A Richardson-Jones,JA Koeple,SM Lewis和R Thom等，后來專家組擴大，增加了部分血液學家，如N Tatsumi、G DOnofrio、G Klee，和生物統(tǒng)計學家CE McLaren等。同時，吸引了Sysmex公司的K Fujimoto和Abbott公司的L van Hove。
ICSH專家組考慮各種血細胞計數的問題，包括令人頭痛的參考標準，因為在細胞計數系統(tǒng)中，自然血液不穩(wěn)定，而穩(wěn)定的非自然紅細胞或人工物質又和新鮮血液不一樣。另一個問題是，所建立參考方法的準確性，目前多為手工法作為設定真值方法，如細胞計數的計數盤法，白細胞分類或網織紅細胞計數的顯微鏡法，而大多數手工操作不能達到處自動法約1-2%的精度。
專家組首先考慮的是確定影響細胞計數的因素，建立參考方法，目前在使用電阻抗原理儀器方面達成了一致。早期，一系列問題影響儀器的設計。為了克服這些問題，專家組提出了一套方法：（1）根據脈沖體積準確設置檢測器，確保能鑒別顆粒和電子噪音，要求信號，噪音比率不超過100：1；（2）要求糾正顆粒同時通過小孔的重合誤差；（3）要求細胞懸液在單位時間內通過小孔時的流速和流量穩(wěn)定；（4）要能避免通過小孔的顆粒再循環(huán)；（5）應選用避免顆粒黏附的材料作為管道、計數池、吸管和稀釋瓶的物質。
經過數十年的工作，目前在血液學方面ICSH出版了30余篇相關論文或書籍，列舉如下：
1.Recommended Methods for the Determination of Packed Cell Volume by Centrifugation.WHO DocumentLAB/89.1,1989;
Biochi Clin 14,405-10,1990
2.ICSH Recommendations for the Analysis of Red Cell,White Cell and Platelet Size Distribution Curves.Methods for Fitting a Single Reference Distribution and Assessing its Goodness of Fit.Clin Lab Haematol 12,417-31,1990
3.ICSH Guidelines for Reticulocyte Counting by Microscopy on Supravitally Stained Preparations.WHO document LBS/92.3
4.Calibration and Maintenance of Semi-Automated Haematology Equipment.WHO document LBS/92.8
5.Recommendations of the ICSH for Ethylenediaminetetraacetc Acid Anticoagulation of Blood for Blood Cell Counting and Sizing.Am J Clin Path100,371-2,1993
6.Reference Method for the Enumeration of Erythrocytes and Leucocytes.Clin Lab Haematol 16,131-8,1994
7.Guidelines for the Evaluation of Bood Cell Analyzers Including those Used for Differential Leuko cyte and Reticulocyte Counting and Cell Marker Applications.Clin Lab Haematol16,157-74,1994
8. Recommendation of the ICSH on Reporting Differential Leukocyte Counts.Clin Lab Haematol17,113,1995
9.Stability of Haemiglobin Cyanide Standards,J Clin Path49,275-7,1996
10.Recommendations for Reference Method for Haemoglobinometry in Humman Blood (ICSH Stand and 1995)and Sepecifications for International Haemiglobincyanide Standard(4th edition).J Clin Path 49,271-4,1996
11.Recommended Method for the Determination of the Haemoglobin Concentration of Blood.WHO document LAB/84.10;Revised 1991
12.Revised Recommendations for the Measurement of the Serum Iron in Human Blood.Br J Haematol 75,615-6,1990
13.Stable Lyophilized Reagents for the Serum Ferritin Assay.Clini Lab Haematol 13,297-305,1991
14.Interpretation of Measured Red Cell Mass and Plasma Volume in Adults.Br J Haematol 89,748-56,1995
15.Announcement:Nomenclature of Platelet—Specific Antigens.British Journal of Haematoloty 74,239-40,1990 Revised Guidelines for Compatibility Testing in Hospital Blood Banks:Important Changes for Quality Assurance and Procedures.Clini Lab Haematol 12,235-6,1990
16.Recommended Procedures for the Classification of Acute Leukaemias.Leuk Lympho 11,37-50,1993
17.ICSH Recommendations for Measurement of Erythrocyte Sedimentation Rate.J Clini Path 46,Rate.WHO document LAB/93.1
18.Recommendations for Standardization,Safety and Quality Control of Erythrocyte Sedimentation Rate.WHO document LAB/93.1
19.Haematology Laboratory Management and Practice.S.M.Lewis and J.A.Koepke,eds.Butterworth—Heinemann,Oxford,UK,1995
20.Huefner Memorial Symposium:Analytical and Physiological Aspects of 100 Years of Hemoglobin Research.Lab Hematol 1,30-36;143-69,1995.van Assendelft OW,Introduction 1,143-4,1995 The Oxygen—Binding Capacity of Human Hemoglobin.Zijlstra WG,Huefner Memorial Lecture:1,145-53,1995.Reference Method for the Measur-
ement of Hemoglobin.van Assendelft OW,Buursma A,1,154-
5,1995,Spectrophotometric and Oxygen-Binding Properties of Human Whole Blood.Zwart A,1,156-60,1995.CO-Oximetric Measurement of Oxyhemoglobin,Deoxyhemoglobin,and Dyshe-
moglobins in Blood:Effects of Analytical Wavelength and Reference Method Selection.Brunelle JA,Degtiarov AM,Moran RF,Race LA,1,161-4,1995.Vasoconstriction and the Effic-
acy of Hemoglobin-Based Blood Substitutes.Wislow RM,1,165-9,1995.Blood Substitutes and their Possile Interference with Routine Laboratory Hematology Tests.Houwen B,Kim JC,Change L,Clement L,Hav K,Hull B,Klein O,Mast BJ,Lebeck LK,1,30-6,1995.
21.Review Article.Standardization and Harmonization of the Blood Count.The role of ICSH.S.M.Lewis.Euro J Haem-
Atoll 4,Suppl 53,9-13,1990
22.Evaluation of a 200 mm Long Vacuum Aspiration Tube for Measurement of Erythrocyte Sedimentation Rate.M.Cas-
Well and J.Stuart.J Clin Path 44,429-30,1991
23.New evelopments inEstabishing Reference Methods in Blood Cel Counting.Lab Med 19,191-201,1995
24.Calibration and Control of Basic Blood Cell Counters.WHO/LAB/97.2
25.Methods for Reticulocyte Counting(flow cytometry & supravitaldyes);ApprovedGuideline.H44-A,Vol.17,No.15.N-CCLS/ICSH joint publication,1997
26.Proposed Reference Method for Reticulocyte Counting Based on the Determination of the Reticulocyte to Red Cell Ratio.Clin Lab Haematol 20,77-9,1998
27.Guidelines for the Organisation and Management of External Quality Assessment Schemes Using Proficiency Testing.Int J Hematol 69,45-52,1998
28.Advanced Lboratory Methods in Haematology Edited by RM Rowan,OW van Assendelft and FE Preston,Edware Arnold Ltd,433p,2002
29.Platelet Counting by the RBC/Platelet Ratio Method:A Reference Method.ICSH and ISLH.Am J Clin Path.115,460-464,2001
30.Recommendations for Single—Use Evacuated Containers for Blood Specimen Collection for Hematological Analyses.ICSH Lab Hematol 8,1-6,2002
31.Specimen Collection,Storage and Transmission to the Laboratory for Hematological Test.ISH/ICSH.Inter Hematol,75,261-268,2002
32.Recommendations for Reference Method for the Packed Cell Volume.ICSH Lab Hematol 7,148-170,2001
二、校準
現代多參數血液分析儀的校準主要通過調整每個同道的稀釋因子和信號強度達到。目前，至少有6個參數需要調整，包括白細胞計數、紅細胞計數、紅細胞壓積或MCV、血紅蛋白濃度、血小板計數和白細胞分類。
調整方法有兩種：一是采用參考方法定值的新鮮血液，與儀器測定值進行比較；二是采用中間物質，如校準品，一種穩(wěn)定化的血液，通過測定相對于全血的回收率，得到恰當的校準值。無論何種方法，首先必須建立每個參數參考方法/標準品，得到全血標本的參考值。參考方法和參考品由標準化組織建立，如ICSH或NCCLS。
表1列舉了血液分析儀的參考方法�？梢�，部分參數有一種以上參考方法，部分沒有參考方法或待建立。這是造成不同儀器間偏倚因不同參考方法而異，雖然這些差異是很細微的。
表1 現代血液分析儀實踐指南
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參 數 |
ICSH |
NCCLS |
爭論點 |
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血紅蛋白 |
HiCN國際參考品 |
H15，HiCN |
排除紅細胞基質渾濁 |
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紅細胞壓積 |
微量離心法 |
H7，微量離心法 |
殘留血漿 |
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白細胞計數 |
ZBI方法 |
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紅細胞計數 |
ZBI方法 |
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血小板計數 |
流式細胞儀間接計數血小板 |
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直接/間接 |
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白細胞分類 |
流式細胞儀（待建立） |
H20，顯微鏡法 |
精度 |
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細胞大小分析 |
正態(tài)擬合 |
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紅細胞正態(tài)擬合 |
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平均紅細胞體積 |
待建立 |
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網織細胞計數 |
流式細胞計數和活體染色 |
H44，流式細胞計數和活性染色 |
目視/流式 |
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