利用組織工程技術再生軟骨組織的實驗研究

關鍵詞： 細胞；軟骨；再生；組織工程 

　　【摘要】　目的　在有免疫力的動物體兔體內探索組織工程化軟骨生成的影響因素�！》椒ā〗�(jīng)不同物質修飾的聚羥基乙酸支架與軟骨細胞體外培養(yǎng)，觀察基質產生情況，并將細胞支架復合物體內回植，觀察軟骨的生成，并進行組織學及超微結構評價�！〗Y果　以卵磷脂、多聚賴氨酸及聚乳酸共同修飾的聚羥基乙酸與軟骨細胞體外培養(yǎng)，結果基質產生旺盛，體內回植后軟骨生成良好�！〗Y論　細胞支架復合物體外培養(yǎng)期間有基質產生，是組織工程化軟骨生成的前提條件；以卵磷脂、多聚賴氨酸及聚乳酸共同修飾的聚羥基乙酸支架與軟骨細胞復合培養(yǎng)后回植到有免疫力的動物體內可生成組織工程化軟骨。

　　The experimental study of morphogenesis of cartilage tissues by means of tissue engineering techniques LIU Yanchun，WANG Wei，CAO Yilin，et al. Department of Plastic Surgery，Shanghai Ninth People�竤 Hospital，Affiliated to Shanghai Second Medical University，Shanghai，200011

　　【Abstract】 Objective To find the factors affecting the morphogenesis of tissue-engineered cartilage in animals who have inherent immunity. Methods To culture chondrocytes seeded onto polyglycolic acid（PGA） scaffolds coating with different materials，observe the production of matrices secreted by chondrocytes and implant the constructs of chondrocytes and scaffolds into subcutaneous of rabbits.The formation of cartilage were evaluated using histology and electron microscope. Results The chondrocytes produced more matrices when seeded onto PGA scaffolds coating with PLA，LEC and PLYS.The formation of cartilage was excellent when the constructs above were implanted into the subcutaneous of rabbits. Conclusion The more production of matrices，the better formation of tissue-engineered cartiolage；The constructs of chondrocytes seeded onto PGA coating with PLA，LEC and PLYS can form tissue-engineerd cartilage in animals who have inherited immunity.

　　【Key Words】 Cells Cartilage Regeneration Tissue-engineered

　　目前有關組織工程化軟骨的研究大部分是在無免疫力的裸鼠體內進行［1］。在有免疫力的動物體內形成組織工程化軟骨的研究報道較少，而且目前所用固體細胞培養(yǎng)支架主要是以聚乳酸修飾的聚羥基乙酸，存在著親水性差，對細胞吸附力弱等缺點［2］。本課題通過不同物質修飾的聚羥基乙酸與軟骨細胞體外培養(yǎng)后回植，探討在有免疫力的動物兔體內組織工程化軟骨形成的影響因素，為軟骨組織工程技術過渡到臨床應用提供理論依據(jù)。

　　 材料與方法

　　一、聚羥基乙酸支架的表面修飾

　　將直徑15 μm纖維間隔150～200 μm厚度100μm的聚羥基乙酸 （Polyglycolic　acid，簡寫PGA）無紡網(wǎng)（DAVIS-GECK公司提供）以2％的聚乳酸（Polyglycolic　acid，簡寫PLA）二氯甲烷溶液包埋固定再分別以1％的卵磷脂（Lecithin，簡寫LEC）無水乙醇溶液及10％多聚賴氨酸（Poly-1-lysine，簡寫PLYS）包埋，得到四種經(jīng)不同物質修飾的聚羥基乙酸支架；（1）PGA加PLA；（2）PGA加PLA加LEC；（3）PGA加PLA加PLYS；（4）PGA加PLA加LEC加PLYS。支架消毒采用75％酒精浸泡及紫外線照射。

　　二、軟骨細胞懸液制備［3］

　　取新西蘭大白兔一側耳廓軟骨（兔體重2.0～2.5　kg，雌雄不限）。所取軟骨剝去軟骨膜，剪成0.1　cm×0.1　cm大小的碎片，以磷酸鹽緩沖液（PBS，含青霉素200 U／ml，鏈霉素200 μg／ml）沖洗兩遍，以去除殘余血跡。然后加入兩倍于軟骨體積的Ⅱ型膠原酶（Sigma　公司，3　mg／ml）在37℃恒溫振蕩器內消化。4～5小時收獲細胞1次，2～3次后軟骨碎片完全溶解細胞從基質中釋放出來。經(jīng)過濾、漂洗、計數(shù)制成細胞懸液，濃度為5×107個／ml。

　　三、培養(yǎng)液用F-12培養(yǎng)基加入10％的小牛血清及青霉素100 U／ml，鏈霉素100 μg／ml。

　　四、細胞支架復合物體外培養(yǎng)

　　將上述支架分別裁剪成1.5　cm×2.0　cm大小，每個支架中加入細胞懸液250 μl，然后將4種細胞支架復合物分別置入60 mm培養(yǎng)皿中，放入37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中，4小時后加入培養(yǎng)液5 ml，抗壞血酸50 μg／ml，人轉化生長因子-bl（TGF-bl，MegaGene公司）10 ng／ml，人堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF，MegeGene公司）2 ng／ml。培養(yǎng)液每3天更換1次。定期在倒置顯微鏡下觀察細胞與支架的吸附、生長繁殖及基質產生情況。

　　五、細胞支架復合物體內回植

　　新西蘭大白兔12只，于每只兔背部不同部位皮下種植單純四種支架及四種自體細胞支架復合物，3個月后取材進行大體、組織學及透射電鏡檢測觀察有無軟骨組織生成，并與原耳廓軟骨進行比較。

　　結果

　　一、細胞支架復合物體外培養(yǎng)期間觀察

　　培養(yǎng)期間倒置顯微鏡觀察及掃描電鏡檢測見支架1細胞復合物無基質產生；支架2細胞復合物有少量基質產生；支架3細胞復合物于支架纖維間有呈蜘蛛網(wǎng)樣分布的基質產生；支架4細胞復合物于支架纖維之間或支架纖維表面有較多呈蜘蛛網(wǎng)樣分布的基質產生。

　　二、軟骨生成情況觀察

　　3個月后對12只兔背部不同部位皮下埋置物進行大體觀察及組織學、透射電鏡檢測，結果如下：單純支架種植均無軟骨生成；支架1細胞復合物回植12個標本中2個有軟骨生成，但生成的軟骨體積遠遠小于植入的細胞支架復合物體積；支架3、4細胞復全物回植12個標本均有軟骨生成，且生成的軟骨體積基本等于支架復合物體積，組織學及電鏡檢測與原兔耳廓軟骨相同。

　　討論

　　一、細胞支架復合物體外培養(yǎng)期間基質產生情況是評價軟骨細胞功能的指標之一。3、4支架細胞復合物體外培養(yǎng)期間基質產生旺盛，說明軟骨細胞較好地發(fā)揮了功能，主要由于多聚賴氨酸對支架的修飾不僅增強了支架對細胞的吸附性，而且具有促進細胞發(fā)揮功能的作用［4］；1、2支架未經(jīng)多聚賴氨酸包埋，則無或較少有基質產生。

　　二、軟骨生成與否及生成量的多少與細胞支架復合物體外培養(yǎng)期間基質產生情況密切相關。支架1細胞復合物體外培養(yǎng)期間無基質產生，故回植后無軟骨生成；支架2細胞復合物體外培養(yǎng)期間基質產生較少，故12個標本中2個有軟骨生成，且生成軟骨體積遠遠小于細胞支架復合物體積；支架3、4細胞復合物體外培養(yǎng)期間基質產生旺盛，故回植后12個標本均有軟骨生成，且生成軟骨體積基本等于細胞支架復合物體積，其組織學及電鏡檢測與原耳廓軟骨基本相同。

　　三、以往組織工程化軟骨的研究大部分是在無免疫力的裸鼠體內進行，而在有免疫力的動物體內研究報道較少。本實驗證明在有免疫力的動物兔體內可形成組織工程化軟骨組織，為軟骨組織工程技術過渡到臨床應用提供了理論依據(jù)。

參考文獻

　　1　Vacanti CA，Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices.Clin Plas Surg，1994，21：445-448.

　　2　劉彥春，王煒.軟骨工程技術及其應用.中國修復重建外科雜志，1997，11：300-303.

　　3　Klagsbrum　M.Large-scale　preparation　of　chondrocytes.Method　Enzymol，1979，58：560-566.

　　4　劉彥春，王煒，曹誼林，等.包埋后的聚羥基乙酸與軟骨細胞體外培養(yǎng)的實驗研究.中華顯微外科雜志，1998，21：36-38.