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關(guān)鍵詞： 基因 表達(dá) 差異
高等真核生物的基因組一般具有80 000～100 000個(gè)基因，而每一個(gè)細(xì)胞大約只表達(dá)其中的15%［1］�；蛟诓煌�(xì)胞間及不同生長(zhǎng)階段的選擇性表達(dá)決定了生命活動(dòng)的多樣性，如發(fā)育與分化、衰老與死亡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)控等。比較細(xì)胞間基因表達(dá)的差異為我們揭示生命活動(dòng)的規(guī)律提供了依據(jù)。
由于真核細(xì)胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此現(xiàn)有的方法基本上都是利用共同引物將不同的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA為對(duì)象研究基因表達(dá)的差異。1992年 Liang等［2］建立了一種差異顯示反轉(zhuǎn)錄 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），為檢測(cè)成批基因表達(dá)的差異開(kāi)辟了新天地。迄今為止已出現(xiàn)了大量應(yīng)用該技術(shù)的研究報(bào)道［3，4］。然而，盡管應(yīng)用 dDRT-PCR方法已經(jīng)取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進(jìn)之中，但它仍然存在幾個(gè)難以解決的問(wèn)題：(1)重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)［5］；(2)假陽(yáng)性率可以高達(dá)90%［6］；(3)獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。近年來(lái)，針對(duì) dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測(cè)差異表達(dá)基因的方法出現(xiàn)，現(xiàn)僅就這方面的進(jìn)展做一簡(jiǎn)要介紹。
1.基因表達(dá)指紋（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技術(shù)使用生物素標(biāo)記的引物 bio-T13合成 cDNA第一鏈，用 dGTP對(duì)其進(jìn)行末端加尾，再以富含 c的引物引發(fā)合成 cDNA第二鏈。用限制性內(nèi)切酶消化雙鏈 cDNA，以交聯(lián)有抗生物素蛋白的微球捕獲 cDNA3′端，以 t4DNA連接酶連接同前述內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)的適配子，并以 bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進(jìn)行特異的 pCR擴(kuò)增，得到大量的特異 cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標(biāo)記后，固定于微球上的 cDNA片段經(jīng)過(guò)一系列酶切，產(chǎn)生的酶切片段從微球表面釋放出來(lái)，其中那些含有標(biāo)記末端的片段經(jīng)凝膠電泳后構(gòu)成 mRNA指紋圖譜。通過(guò)分析不同細(xì)胞間的指紋圖譜就能得到差異表達(dá)的序列［7］。 gEF技術(shù)所需的工作量較 dDRT-PCR明顯減少，由于用酶切反應(yīng)替代了條件不嚴(yán)格的 pCR反應(yīng)，其重復(fù)性也較好，假陽(yáng)性率低，并且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。 gEF技術(shù)最大的缺點(diǎn)在于電泳技術(shù)的局限。由于它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經(jīng)過(guò)幾輪酶切之后常會(huì)得到1 000～2 000條電泳帶，而現(xiàn)有的 pAGE電泳很少能分辨超過(guò)400條帶，故只有15%～30%的 mRNA能夠被辨認(rèn)出來(lái)，因此得到的只能是高表達(dá)基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡(jiǎn)單有效的方法；如果希望得到有關(guān)某種細(xì)胞的基因表達(dá)譜，可能比較困難；采用雙向電泳技術(shù)可能會(huì)有所幫助［8］。
2．基因表達(dá)系統(tǒng)分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基于兩條理論。首先，一段來(lái)自某個(gè)轉(zhuǎn)錄子確定位置的核苷酸，其長(zhǎng)度只要有9～10個(gè) bp，就能夠特異地確認(rèn)該轉(zhuǎn)錄子。第二，對(duì)短片段標(biāo)簽的鏈接有利于在同一克隆中對(duì)多個(gè)標(biāo)簽測(cè)序。 sAGE也是用生物素標(biāo)記的 bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈 cDNA，然后以限制酶（錨定酶）進(jìn)行酶切，捕獲 cDNA3′端。在此處產(chǎn)物被分為兩部分，分別與包含有 iIS型內(nèi)切酶（標(biāo)簽酶）位點(diǎn)的 a、 b連接子相接。 iIS型內(nèi)切酶的特點(diǎn)是作用位點(diǎn)處于識(shí)別位點(diǎn)之外。這樣經(jīng)過(guò)酶切，就有可能得到只有9～10bp的標(biāo)簽序列。每?jī)蓚�(gè)標(biāo)簽的鈍端結(jié)合后成為 pCR的模板，以基于 a、 b連接子的引物進(jìn)行 pCR反應(yīng)的結(jié)果是得到了大量每條包含兩個(gè)不同來(lái)源標(biāo)簽的序列，接下來(lái)再用錨定酶酶切、連接，就能將多個(gè)不同的標(biāo)簽鏈接在一起（大約為每條包含數(shù)十個(gè)不同來(lái)源的標(biāo)簽），克隆至質(zhì)粒載體中后集中測(cè)序［9，10］。 sAGE的最終結(jié)果是通過(guò)計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)得到的，根據(jù)某個(gè)標(biāo)簽出現(xiàn)頻率的高低來(lái)判斷并計(jì)算其所屬基因表達(dá)的豐度。對(duì)于在數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到對(duì)應(yīng)序列的標(biāo)簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識(shí)別位點(diǎn)的4bp）對(duì) cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，以尋找新基因。 sAGE可以檢測(cè)不同細(xì)胞間已知基因表達(dá)的具體差異，精確到每個(gè)細(xì)胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達(dá)譜，系統(tǒng)地分析基因表達(dá)的差異。它的缺點(diǎn)在于工作量非常大，有大量的測(cè)序及計(jì)算機(jī)分析任務(wù)；而且，對(duì)于尋找新基因而言，僅用長(zhǎng)度為13bp的寡核苷酸探針篩選 cDNA文庫(kù)是很不嚴(yán)格的，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，往往是假陽(yáng)性結(jié)果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段顯示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用帶有“踵”結(jié)構(gòu)的錨定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一鏈，以 okayama和 berg的置換法合成 cDNA第二鏈，然后將雙鏈 cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由 a1和 a2兩條寡核苷酸構(gòu)成，其序列與所用限制酶識(shí)別位點(diǎn)相符合，先將 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就會(huì)形成一個(gè) y型結(jié)構(gòu)；把 y型適配子與酶切后的 cDNA片段相連接，以適配子及錨定引物中所含序列為特異引物進(jìn)行 pCR反應(yīng)，則只有 cDNA3′末端的一段被擴(kuò)增出來(lái)，這時(shí)的產(chǎn)物可用凝膠電泳表示出來(lái)構(gòu)成差異表達(dá)圖譜。對(duì)于每次切割6bp的限制酶來(lái)說(shuō)，每種大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有 cDNA都顯示出來(lái)［11］。 cDNA3′端 rFD與 gEF的思路比較相似，由于它利用多種限制酶進(jìn)行酶切，因此不會(huì)象 gEF因凝膠電泳分辨率不夠而漏掉信息。它的重復(fù)性較好，假陽(yáng)性率低，尤其是對(duì)于已知基因，可以根據(jù)選擇內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)確定該基因在凝膠電泳中的位置并判斷其含量，從而避免了進(jìn)一步的分析。對(duì)于精力有限的研究人員，這可能是個(gè)值得一試的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相類(lèi)似的缺點(diǎn)，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時(shí)間對(duì)所得到的差異條帶進(jìn)一步分析。
4.分子指數(shù)的 rNA指紋（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一種能夠較好地顯示 mRNA中編碼序列的方法。它利用Ⅱ s型內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外可以形成一個(gè)4bp的突出端的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)43共64種（最外側(cè)一個(gè)核苷酸隨機(jī)）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規(guī)方法合成雙鏈 cDNA，用Ⅱ類(lèi)限制酶進(jìn)行酶切后連接5′端磷酸化的相應(yīng)適配子，再以Ⅱ s類(lèi)內(nèi)切酶酶切后形成一個(gè)隨機(jī)的4 bp突出端，用連接有生物素的64種適配子予以結(jié)合，可將這些限制片段分為64類(lèi)，用包被抗生物素蛋白的磁珠捕獲連接產(chǎn)物，就可以利用前后兩個(gè)適配子所攜帶的特異序列為引物進(jìn)行 pCR擴(kuò)增反應(yīng)，凝膠電泳顯示表達(dá)差異［12］。由于擴(kuò)增的序列位于 cDNA內(nèi)部，因此最后得到編碼序列的可能性很大，這是該方法最大的優(yōu)點(diǎn)。鑒于并不是所有 cDNA都含有某一識(shí)別位點(diǎn)，故采用不同的內(nèi)切酶組合。理論上可以顯示所有的差異表達(dá)基因，但這樣一來(lái)工作量就變得十分巨大。因此，該方法只適合對(duì)樣本的快速分析和部分差異表達(dá)基因的研究；如果要對(duì)某種細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行全面的研究，可能還要采用其它的方法。
5.抑制性消減雜交（ suppression subtractive hybridization， sSH）: SSH方法源于代表性差異分析法（ representational difference analysis, RDA）。它原是一種研究基因組之間差異的以雜交為基礎(chǔ)的方法。 diatchenko等［13］將“抑制性 pCR”理論［14］與 rDA相結(jié)合，建立了一種分離差異表達(dá)基因的新方法。 sSH將需要檢測(cè)的細(xì)胞稱(chēng)為“檢測(cè)子”，將對(duì)照細(xì)胞 mRNA稱(chēng)為“驅(qū)趕子”，把 mRNA合成 cDNA后，通過(guò)僅僅兩輪雜交和 pCR過(guò)程，就能有效地分離到在檢測(cè)子中表達(dá)，而在驅(qū)趕子中不表達(dá)或表達(dá)豐度不同的 mRNA（圖5）。通過(guò) sSH有可能得到某種細(xì)胞中相對(duì)其他組織的差異表達(dá)基因的全面信息，它較好地克服了其它方法中低豐度基因難以得到的問(wèn)題，據(jù)稱(chēng)對(duì)低拷貝基因的富集可以達(dá)到1 000～5 000倍，因此可能發(fā)現(xiàn)一些用原有方法沒(méi)有檢測(cè)到的新基因。這方面已經(jīng)有人進(jìn)行了嘗試［15，16］，獲得了一些成果。 sSH的不足之處在于它需要 mRNA的量較大，檢測(cè)子和驅(qū)趕子都要達(dá)到2微克以上，這在某些情況下是非常難以做到的，因此目前有關(guān) sSH的報(bào)道基本上都以腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象。
基因表達(dá)差異的研究方法在 dDRT-PCR出現(xiàn)之后又有了很大的發(fā)展，每種方法都各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員應(yīng)該根據(jù)自己的側(cè)重點(diǎn)選擇適合于自己的方法。目前真正能夠做到簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、全面地揭示基因表達(dá)差異的方法仍在不斷探索之中，因此許多研究機(jī)構(gòu)仍采用 dDRT-PCR來(lái)達(dá)到自己的目的，畢竟經(jīng)過(guò)最近數(shù)年的完善，該技術(shù)在許多方面都有了一定的改進(jìn)，完成一般的研究項(xiàng)目已是綽綽有余。 sSH作為一種基因表達(dá)差異研究的新方法，假陽(yáng)性率低，所得到的結(jié)果也更加全面，因此，希望以不太復(fù)雜的方法全面揭示差異表達(dá)基因的研究者，可以嘗試一下這種方法。
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