補(bǔ)腎益精方延緩老年雄性大鼠骨與腦衰老的實(shí)驗(yàn)研究

內(nèi)容提要　目的：評價(jià)補(bǔ)腎益精方延緩老年雄性大鼠骨衰老與腦衰老的作用，探討此方延緩整個(gè)機(jī)體衰老的機(jī)制。方法：40只24月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為24月齡本底對照組、30月齡增齡對照組、補(bǔ)腎益精方低劑量組、補(bǔ)腎益精方高劑量組，每組各10只。低劑量組、高劑量組均自24月齡給藥至30月齡。各組相應(yīng)處理以后分別測定各組大鼠的骨參數(shù)(左側(cè)股骨近段、中段、遠(yuǎn)段的骨密度和右側(cè)股骨的彎曲斷裂載荷)以及腦參數(shù)(腦組織M受體結(jié)合容量和膽堿酯酶活性)。結(jié)果：在骨方面，補(bǔ)腎益精方既能量效依賴性地增加大鼠股骨各段骨密度，又能量效依賴性地提高大鼠股骨彎曲斷裂載荷；在腦方面，補(bǔ)腎益精方不僅能上調(diào)大鼠腦組織M受體結(jié)合容量，而且又能抑制大鼠腦組織膽堿酯酶活性。結(jié)論：補(bǔ)腎益精方具有同時(shí)延緩雄性大鼠骨衰老與腦衰老的作用；推測該方似通過神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的介導(dǎo)從整體角度調(diào)整衰老機(jī)體腎虛精虧之異常。

Experimental Study on Effect of Bushen Yijing Recipe in Delaying Senility of Bone and Brain of Aged Male Rats

　　Objective: To evaluate the effect of Bushen Yijing recipe (BSYJR) in delaying senility of bone and brain of aged male rats and infer its mechanism in delaying systemic senility.Methods: Forty male SD rats, 24 months old were randomly divided into 4 groups, the baseline control group, the aged control group (30 months old), the BSYJR high dose group and the BSYJR low dose group. The latter two groups received BSYJR treatment from 24 months old to 30 months old. Bone indexes (bone density of the proximal, middle and distal segments of left femur and break bending load of right femur) and brain& nbsp;indexes (binding capacity of M receptor and cholinesterase activity of brain) were measured after responding treatment.Results: In bone, BSYJR could not only increase the bone mineral density in various segments of femur, but also raise the bending break load of femur dose-effect dependently. In brain, BSYJR could both up-regulate the binding capacity of M receptor and inhibit the activity of cholinesterase.Conclusion: BSYJR could delay the senility of bone and brain in male rats, inferring that it might regulate integrally the abnormality of aging in Kidney Asthenia and Essence Deficiency through mediation of nerve-endocrine-immunity network. To evaluate the effect of Bushen Yijing recipe (BSYJR) in delaying senility of bone and brain of aged male rats and infer its mechanism in delaying systemic senility.Methods: Forty male SD rats, 24 months old were randomly divided into 4 groups, the baseline control group, the aged control group (30 months old), the BSYJR high dose group and the BSYJR low dose group. The latter two groups received BSYJR treatment from 24 months old to 30 months old. Bone indexes (bone& nbsp;density of the proximal, middle and distal segments of left femur and break bending load of right femur) and brain indexes (binding capacity of M receptor and cholinesterase activity of brain) were measured after responding treatment.Results: In bone, BSYJR could not only increase the bone mineral density in various segments of femur, but also raise the bending break load of femur dose-effect dependently. In brain, BSYJR could both up-regulate the binding capacity of M receptor and inhibit the activity of cholinesterase.Conclusion: BSYJR could delay the senility of bone and brain in male rats, inferring that it might regulate integrally the abnormality of aging in Kidney Asthenia and Essence Deficiency through mediation of nerve-endocrine-immunity network.

　　Key words　Bushen Yijing Recipe, aged rats, bone density, bone load, integrated regulation, nerve-endocrine-immunity network, M receptor, cholinesterase

　　根據(jù)中醫(yī)學(xué)的整體觀念和“腎主骨生髓，腦為髓之海”的理論，80年代以來國內(nèi)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)者分別應(yīng)用不同的補(bǔ)腎益精類中藥復(fù)方有效地延緩骨衰老(老年性骨質(zhì)疏松癥)、腦衰老(老年性癡呆)的研究報(bào)告已經(jīng)屢見不鮮(1～7)，但是分別觀察同一個(gè)補(bǔ)腎益精的中藥復(fù)方延緩骨衰老、腦衰老的研究尚不多見；然而這種類型的研究卻具有非常重要的意義；因?yàn)橐环蕉嘈У难芯拷Y(jié)果可以提供基于整體觀念的中醫(yī)抗衰老理論最直接的藥效學(xué)證據(jù)。因此，本項(xiàng)研究通過觀察由何首烏、肉蓯蓉等數(shù)種天然植物組成的具有補(bǔ)腎益精功效的中藥復(fù)方——補(bǔ)腎益精方對雄性大鼠骨衰老與腦衰老的影響，旨在評價(jià)本方延緩老年大鼠骨衰老與腦衰老的作用以及探討該方延緩機(jī)體衰老的機(jī)制，為中醫(yī)藥抗衰老提供整體防治的證據(jù)。

　　材料與方法

　　1　動(dòng)物　 24月齡SD雄性大鼠40只，(450±20)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，上海市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會實(shí)動(dòng)合格證書號0017500；各組大鼠分籠飼養(yǎng)；自由攝取標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料(鈣1.01%，磷0.78%)；自由飲用蒸餾水；室溫(18±2)℃。

　　2　藥物　補(bǔ)腎益精方(仙靈脾10g　何首烏15g肉蓯蓉10g　骨碎補(bǔ)10g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。應(yīng)用蒸餾水將補(bǔ)腎益精方膠囊制劑藥粉配制成為懸濁液(濃度0.6g藥粉/ml藥液)，低劑量組按照10ml藥液/kg體重的劑量給藥(相當(dāng)于成人用量的10倍)、高劑量組按照30ml藥液/kg體重的劑量給藥(相當(dāng)于成人用量的30倍)。

　　3　儀器　SPA-Ⅳ型單光子骨密度儀(中國成都測試技術(shù)研究院)，放射源125I；INSTRON-1122型萬能材料試驗(yàn)機(jī)(英國)；Wallac 1410液體閃爍計(jì)數(shù)器(Pharmacia)；Wellscan MK2酶標(biāo)儀(Labsystems Dragon)。

　　4　動(dòng)物分組與處理　40只24月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為24月齡本底對照組、30月齡增齡對照組、補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方低劑量組、補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方高劑量組，每組各10只。24月齡本底對照組大鼠適應(yīng)性正常喂養(yǎng)1周以后，全部處死；30月齡增齡對照組大鼠自24月齡正常喂養(yǎng)至30月齡時(shí)全部處死；低劑量組、高劑量組大鼠均自24月齡正常喂養(yǎng)的同時(shí)自由飲用補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方制劑懸濁液，至30月齡時(shí)全部處死。

　　5　觀察指標(biāo)及其檢測方法

　　5.1　股骨近、中、遠(yuǎn)段骨密度及其測定　處死大鼠以后，取出左側(cè)股骨，應(yīng)用70%乙醇固定，剝離軟組織；使用HB鉛筆在剝離軟組織的股骨的近、中、遠(yuǎn)段分別標(biāo)記3條線(A線：股骨近段股骨小轉(zhuǎn)子根部遠(yuǎn)側(cè)；B線：股骨遠(yuǎn)段股骨髕面近側(cè)；C線：A線與B線之中點(diǎn))。沿標(biāo)記的每一條線作骨橫越掃描3次，計(jì)算3次獲得的骨密度平均值，作為此線代表的股骨某段的骨密度。

　　5.2　股骨彎曲斷裂載荷及其測定　處死大鼠以后，取出右側(cè)股骨，應(yīng)用70%乙醇固定，剝離軟組織；置于萬能材料試驗(yàn)機(jī)的支架上(跨距＝24mm)，以10mm/min的速度下壓股骨中段，記錄紙上呈現(xiàn)力線突然斷裂的時(shí)候，記下此時(shí)股骨承受的彎曲載荷。

　　5.3　M受體結(jié)合容量及其測定　處死大鼠以后，斷頭取腦，分離腦組織，迅速加入制備緩沖液(50mmol/L KH2PO4-NaOH，10mmol/L MgCl2，0.25mol/L蔗糖，pH＝7.7)，用高速分散器勻漿。然后以3000r/min離心10min，取上清液，再以27000r/min離心15min，取沉淀，加反應(yīng)緩沖液(50mmol/L KH2PO4-NaOH，10mmol/L MgCl2，0.2%維生素C，pH7.7)，用高速分散器制成懸浮液備用。同時(shí)采用微量Lowry法改進(jìn)法測蛋白含量。以上操作均在0～4℃進(jìn)行。按受體放射性配基結(jié)合分析法，測定M受體結(jié)合容量。

　　5.4　乙酰膽堿酯酶活性及其測定　處死大鼠以后，斷頭取腦，分離腦組織，稱重后加1/15mol/L磷酸緩沖液，制成勻漿，然后以1500r/min離心15min，上清液即為酶樣本。按羥胺比色法(8)，略加改進(jìn)測定乙酰膽堿酯酶活性。

　　6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　各組測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)法。

　　結(jié)　　果

　　1　補(bǔ)腎益精方對老年雄性大鼠股骨各段骨密度及其彎曲斷裂載荷的影響　見表1。由表1可知，增齡對照組大鼠股骨各段骨密度明顯低于本底對照組大鼠(P＜0.05)，增齡對照組大鼠股骨彎曲斷裂載荷明顯低于本底對照組大鼠(P＜0.05)；與增齡對照組比較，低劑量組近段、中段、遠(yuǎn)段骨密度分別增加了18%(P＞0.05)、16%(P＞0.05)、1%(P＞0.05)，高劑量組近段、中段、遠(yuǎn)段骨密度分別增加了30%(P＜0.05)、23%(P＜0.05)、12%(P＜0.05)，但是與本底對照組比較，高劑量組各段骨密度尚未達(dá)到本底對照組的水平(P＜0.05)；低劑量組股骨彎曲斷裂載荷增加了24%，高劑量組股骨彎曲斷裂載荷增加了33%，但是與本 底對照組比較，高劑量組股骨彎曲斷裂載荷尚未達(dá)到本底對照組的水平(P＜0.05)。

表1　補(bǔ)腎益精方對老年雄性大鼠股骨各段骨密度及其彎曲斷裂載荷的影響　(±s)

組　別 n 近段骨密度 中段骨密度 遠(yuǎn)段骨密度 彎曲斷裂載荷

　　(N)
 
(g/cm2) 
本底對照 10 0.27±0.01 0.31±0.03 0.23±0.02 143.00±14.17 
增齡對照 10 0.19±0.03△ 0.22±0.03△ 0.18±0.02△ 102.00±12.39△ 
低劑量 10 0.22±0.03△ 0.25±0.04△ 0.19±0.01△ 127.00±27.50△ 
高劑量 10 0.25±0.01*△ 0.27±0.01*△ 0.20±0.01*△ 137.00±7.50*△ 

　　注：與增齡對照組比較，*P＜0.05；與本底對照組比較，△P＜0.05　　2　補(bǔ)腎益精方對老年雄性大鼠腦組織M受體結(jié)合容量和乙酰膽堿酯酶活性的影響　見表2。增齡對照組大鼠腦組織M受體結(jié)合容量明顯低于本底對照組大鼠(P＜0.05)，增齡對照組大鼠乙酰膽堿酯酶活性與本底對照組大鼠比較沒有明顯差異；與增齡對照組比較，低劑量組與高劑量組大鼠腦組織M受體結(jié)合容量明顯上升(P＜0.05)，并且與本底對照組比較，低劑量組與高劑量組均達(dá)到本底對照組的水平；低劑量組與高劑量組大鼠乙酰膽堿酯酶活性明顯受到抑制(P＜0.05)。

表2　補(bǔ)腎益精方對老年雄性大鼠腦組織M受體結(jié)合容量

　　和乙酰膽堿酯酶活性的影響　(±s)

組　別 n M受體結(jié)合容量

　　(fmol/mg蛋白)　　
 乙酰膽堿脂酶活性

　　(μmol·h－1.g－1)　　
 
本底對照 10 782.89±143.62 211.90±57.91 
增齡對照 10 575.23±81.64△ 206.89±64.51 
低劑量 10 884.29±107.01*△ 170.13±90.23*△ 
高劑量 10 1109.19±267.83*△ 169.85±75.37*△ 

　　注：與增齡對照組比較，*P＜0.05；與本底對照組比較，△P＜0.05

討　　論

　　1　衰老病機(jī)(腎虛精虧)與抗衰老治則(補(bǔ)腎益精)　本項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)補(bǔ)腎益精方既能明顯延緩骨衰老(提高骨密度與骨力學(xué)性能)，又能明顯延緩腦衰老(提高腦M受體結(jié)合容量，抑制腦膽堿酯酶活性)。令人產(chǎn)生興趣的是針對腦衰老與骨衰老卻都使用以補(bǔ)腎益精作為治則的同一個(gè)中藥復(fù)方，并且作用都非常明顯。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，這種“異病同治”的現(xiàn)象不僅提示了不同的衰老疾病之間存在一個(gè)共同的病機(jī)，按照“以藥探理”的思路可以認(rèn)為腦衰老病機(jī)與骨衰老病機(jī)都可以歸結(jié)成為腎虛精虧，而且也說明了“腎”、“精”、“髓”、“腦”、骨”之間的生理病理的有機(jī)聯(lián)系。

　　2　神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的整體調(diào)節(jié)機(jī)制　至于補(bǔ)腎益精方是通過何種整體途徑發(fā)揮延緩機(jī)體不同組織(骨組織、腦組織等)衰老的效應(yīng)，最近有學(xué)者應(yīng)用受體放射性配基結(jié)合分析法、放射免疫分析法觀察了補(bǔ)腎益精方對老年大鼠腦組織、脾組織的神經(jīng)遞質(zhì)受體以及血清內(nèi)分泌激素的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示補(bǔ)腎 益精方可以通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)對機(jī)體的整體調(diào)節(jié)以及免疫應(yīng)答對神經(jīng)—內(nèi)分泌軸的反饋調(diào)節(jié)，產(chǎn)生明顯延緩腦組織衰老的作用(1)。如果考察骨組織與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的關(guān)系，那么可以發(fā)現(xiàn)骨代謝的調(diào)控與內(nèi)分泌激素—鈣磷調(diào)節(jié)激素以及性激素的參與密切相關(guān)(9～11)，并且內(nèi)分泌系統(tǒng)又以神經(jīng)內(nèi)分泌軸的功能形式存在，同時(shí)骨組織中啟動(dòng)骨重建的始發(fā)細(xì)胞—破骨細(xì)胞亦起源于免疫細(xì)胞系統(tǒng)—單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(12)，而且細(xì)胞因子在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)中承擔(dān)的信號傳遞分子的角色已經(jīng)成為人們的共識(13，14)，其中包括具有骨吸收刺激作用的IL-1、TNF等以及具有骨吸收拮抗劑樣作用的TGF-B等。由此推測補(bǔ)腎益精方延緩整個(gè)機(jī)體的衰老是否通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的介導(dǎo)從多方位多層次地調(diào)節(jié)衰老機(jī)體腎虛精虧之異常，值得進(jìn)一步研究。

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