中國生物制品規(guī)程:人二倍體細(xì)胞建株、檢定及制備疫苗規(guī)程

人二倍體細(xì)胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等。

[B]A細(xì)胞株的要求[/B]

用于疫苗生產(chǎn)的人二倍體細(xì)胞株（以下簡稱細(xì)胞株)須按下列規(guī)定進(jìn)行全面檢定。新建立細(xì)胞株，應(yīng)按《新生物制品審批辦法》進(jìn)行審批。

1　建立細(xì)胞株必須具備下列資料

1.1　建立細(xì)胞株所用的胎兒的胎齡和性別，中止妊娠原因。

1.2　建立細(xì)胞株所用胎兒的父、母年齡、職業(yè)及健康狀況，胎兒父、母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷和腫瘤疾病歷史。在取胎兒組織時，應(yīng)作出詳細(xì)調(diào)查，報衛(wèi)生部審批前，應(yīng)進(jìn)行一次重復(fù)調(diào)查。

1.3　原始組織種類，原代培養(yǎng)的數(shù)量與生長狀況。

1.4　細(xì)胞培養(yǎng)史和生長特征，細(xì)胞壽命、世代數(shù)。

1.5　細(xì)胞生長液的成分。

2　細(xì)胞株的檢定

2.1　染色體的鑒定和制片

細(xì)胞原系建株過程，每8～12世代*應(yīng)作一次染色體檢查，一株細(xì)胞整個生命期內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)過程中，至少應(yīng)有4～5次染色體檢查結(jié)果。

每次染色體檢查，應(yīng)從同一世代不同細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞混合再培養(yǎng)，制備染色體標(biāo)本片。染色體標(biāo)本應(yīng)長期保存（直至褪色不能用為止)，以備復(fù)查。

每次染色體檢查，至少應(yīng)隨機取1000個分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并作出有助于復(fù)查的記錄，其中至少選擇50個分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相，作出核型分析。并應(yīng)粗?jǐn)?shù)500個分裂中期細(xì)胞，檢查多倍體的發(fā)生率。

可以G分帶或Q分帶技術(shù)檢查50個中期細(xì)胞染色體帶型，應(yīng)用照相圖片作出帶型分析。以顯帶技術(shù)檢出的核型異常（假二倍體、倒位、易位等)發(fā)生率應(yīng)用比現(xiàn)用上限更寬的基本數(shù)據(jù)進(jìn)行評價，合格上限尚未定出。

2.1.1　合格要求

1000個和500個中醫(yī)細(xì)胞標(biāo)本中，檢查異常率、合格的上限（可信限95%，Poison法)如表1。

表1

*亞二倍性超過上限時，可選用批標(biāo)本片重數(shù)

**+一個中期細(xì)胞內(nèi)超過53條染色體即為一個多倍體

2.1.2　染色體制片要求

應(yīng)及時進(jìn)行制片質(zhì)量檢查，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞堆積，染色體分散不好等，由于技術(shù)原因不適于讀片時，可以及時重新制片。但已經(jīng)讀片后，不斷因某項超過標(biāo)準(zhǔn)（亞二位性除外)而廢棄f1411.cn/shiti/不算。如考慮到制片技術(shù)與質(zhì)量問題，可重試兩次，當(dāng)有一次結(jié)果與原結(jié)果相近時，又無可知原因，應(yīng)以原結(jié)果為準(zhǔn)。

2.2　外源因子檢查

細(xì)胞株不應(yīng)有細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒等污染。每8～12世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行下列檢查。

2.2.1　細(xì)菌、霉菌、支原體檢查

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進(jìn)行。

2.2.2　病毒檢查

2.2.2.1　細(xì)胞直接觀察及紅細(xì)胞吸附試驗

取混合瓶細(xì)胞樣品，接種小瓶或小管，長成單層后更換維持液，觀察2周，鏡檢細(xì)胞，應(yīng)保持正常形態(tài)特征。培養(yǎng)7天，用0.2%～0.5%雞和豚鼠混合紅細(xì)胞懸液進(jìn)行紅細(xì)胞吸附試驗，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分鐘，兩次觀察結(jié)果均應(yīng)為陰性。

2.2.2.2　細(xì)胞培養(yǎng)檢查

細(xì)胞培養(yǎng)的上清液混合樣品，至少接種4種細(xì)胞（原代人腎或猴腎細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、人源傳代細(xì)胞和另一批人二倍體細(xì)胞)。接種的樣品量應(yīng)占維持液的20%以上，于培養(yǎng)5～7天和14天時，進(jìn)行紅細(xì)胞吸附試驗（見2.2.2.1項)。培養(yǎng)7天的上清液在同種細(xì)胞培養(yǎng)上盲傳一代，觀察14天，應(yīng)無細(xì)胞病變，紅細(xì)胞吸附試驗應(yīng)為陰性（在該試驗的細(xì)胞維持液中，允許加入少量該細(xì)胞培養(yǎng)用的牛血清，以利細(xì)胞維持和觀察)。

2.2.2.3　動物試驗檢查

用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和雞胚各一組。每組動物或雞胚接種受檢細(xì)胞不應(yīng)少于10⁷。按表2所列要求進(jìn)行試驗和觀察。如80%以上動物和雞胚健存，此試驗為通過。

2.2.2.4　其他檢查

細(xì)胞株傳代過程中，至少于2個不同世代水平進(jìn)行包涵體、乙型肝炎表面抗原及電鏡檢查，結(jié)果均應(yīng)為陰性。

2.3　腫瘤原體檢查

每8～12世代做一次細(xì)胞株的異種移植試驗，觀察細(xì)胞株有無致腫瘤性質(zhì)，每次實驗使用6只乳鼠（3～5日齡)或體重8～10g小白鼠，經(jīng)抗胸腺血清（ATS)處理，皮下接種活二倍體細(xì)胞（最適傳代的細(xì)胞)，觀察14天，檢查有無結(jié)節(jié)形成。有結(jié)節(jié)或可疑病灶時，做病理切片檢查。試驗同時，用HeLa或其他人源傳代細(xì)胞系做陽性對照試驗，用動物數(shù)與處理方法同試驗組，接種被檢二倍體細(xì)胞數(shù)應(yīng)為對照腫瘤細(xì)胞數(shù)的5倍以上。結(jié)果二倍體細(xì)胞株不應(yīng)有移植瘤形成，而對照組細(xì)胞則應(yīng)有80%或更多的動物有典型移植瘤出現(xiàn)（腫瘤結(jié)節(jié)需經(jīng)病理組織學(xué)診斷)。

表2

*豚鼠于注射前及觀察4周作舊結(jié)核菌素試驗，應(yīng)為陰性

**每只于背部皮內(nèi)注射10處，每處0.1ml

***應(yīng)用豚鼠和雞混合紅細(xì)胞作直接血凝試驗

可以用任何以免疫抑制劑處理，并對腫瘤細(xì)胞有同樣敏感性的其他動物試驗，如無胸腺小白鼠（nude　nu/nu基因型等)。

3　細(xì)胞種子

細(xì)胞株傳代過程的早期，應(yīng)選定適應(yīng)世代數(shù)培養(yǎng)出大量細(xì)胞，制成懸液，分裝安瓿作為細(xì)胞種子。置液氮中凍存，以備細(xì)胞株建成后，大量供應(yīng)細(xì)胞。

凍存的種子細(xì)胞活存率應(yīng)在60%以上。凍存后一定時間，應(yīng)至少復(fù)蘇培養(yǎng)一系至衰老期，并在不同傳代水平，檢查細(xì)胞株的生長、胞核學(xué)特征、異種移植等，證明細(xì)胞經(jīng)凍存后的生物學(xué)性質(zhì)無明顯改變。

[B]B二倍體細(xì)胞用于疫苗生產(chǎn)的要求[/B]

1　細(xì)胞

1.1　細(xì)胞株

用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株，必須符合本規(guī)程要求。不含外源因子、核型正常、對病毒敏感和具有足夠多的細(xì)胞種子。可用KMB-17、2BS等細(xì)胞株。所用細(xì)胞株均須經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。

1.2　細(xì)胞種子批

一個細(xì)胞種子批應(yīng)有足夠量早世代細(xì)胞，分裝安瓿保存于液氮中，作為細(xì)胞種子。

2　生產(chǎn)用細(xì)胞種子批

用一個或數(shù)個細(xì)胞種子安瓿傳代增殖到適宜世代，具有一定量的均一細(xì)胞懸液，分裝安瓿，標(biāo)明世代、安瓿號和凍存的日期，保存于液氮中，作為生產(chǎn)用細(xì)胞種子。

2.1　生產(chǎn)用細(xì)胞種子批檢定

2.1.1　細(xì)菌、霉菌、支原體檢查

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進(jìn)行。

2.1.2　動物和雞胚檢查外源因子

用生產(chǎn)用細(xì)胞種子世代水平或至2/3世代壽命水平的細(xì)胞作檢定樣品。用下列動物和雞胚檢查：

各種動物和雞胚的接種法、觀察期，按照A2.2.2.3條進(jìn)行。

2.1.3　腫瘤原性檢查

按A2.3項執(zhí)行。

2.1.4　染色體的監(jiān)測

檢查用于生產(chǎn)的最后一個世代或其后任一世代，至少檢查500個中期細(xì)胞的多倍性、染色體精確計數(shù)、斷裂率、結(jié)構(gòu)異常及其他異常發(fā)生率，例如螺旋消失或初級次縊痕或次級次縊痕的明顯減弱等。按A2.1.1項進(jìn)行評價。

生產(chǎn)用細(xì)胞庫細(xì)胞染色體監(jiān)測用的染色體標(biāo)本片和照片，應(yīng)作為該細(xì)胞f1411.cn/pharm/批監(jiān)測此細(xì)胞生產(chǎn)疫苗批的記錄，永久保存。

3　生產(chǎn)用細(xì)胞的培養(yǎng)

3.1　從生產(chǎn)用細(xì)胞種子開始傳代培養(yǎng)，以適宜分種率連續(xù)傳代，直至增殖足夠量的細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)。用于生產(chǎn)的細(xì)胞世代，應(yīng)在細(xì)胞整個壽命期的前2/3世代內(nèi)。

3.2　細(xì)胞外源因子檢查

于種毒當(dāng)天，或在連續(xù)傳代種毒，于最后一次細(xì)胞種毒當(dāng)天，此批細(xì)胞留取2%～5%不種毒，換維持液作為正常細(xì)胞對照，以檢查外源因子。從換液之日起觀察2周，細(xì)胞應(yīng)無異常變化。

用換維持液0～2天的對照細(xì)胞上清液，接種原代兔腎、非人靈長類傳代細(xì)胞及另一批人二倍體細(xì)胞，接種樣品量應(yīng)占維持液的20%。觀察14天，換液后5～8天用上清液，在相應(yīng)細(xì)胞盲代一代，觀察14天，做血吸附試驗。

在收毒時，用0.2%～0.5%雞和豚鼠紅細(xì)胞，在2～8℃和20～25℃做血吸附試驗，應(yīng)為陰性。

3.3　細(xì)胞鑒別試驗

在生產(chǎn)用細(xì)胞世代水平或其后數(shù)代，檢查300個中期細(xì)胞，計數(shù)多倍體，作100個中期細(xì)胞染色體檢查，應(yīng)核型正常，鑒別確為本細(xì)胞無誤。

除染色體監(jiān)測外，還可用HLA表面抗原鑒定試驗。

──────────────────

*細(xì)胞“世代”的說明：英文是“Population　doubling”，簡寫“PD”，譯成“群體培增”，為通俗和習(xí)慣以名詞“世代”來表示。PD可按實際計數(shù)，增加一倍，或按細(xì)胞培養(yǎng)面積，增加一倍，為一個PD，即一個世代。也就是細(xì)胞以1:2分種率傳代則為一個世紀(jì)，以1:4分種率傳代則為2個世代，1:8分種率傳代則為3個世代。