自1969年以來，我們高興的看到原位雜交免疫細胞化學技術(shù)已從分子生物學的一個分支發(fā)展成為生命科學的有效的研究方法。在原位雜交免疫細胞化學發(fā)展過程中兩個關(guān)鍵性的突破是核酸探針制備的標記物的改進。核酸探針由克隆的核酸探針發(fā)展到無克隆的合成的寡核苷酸探針；從放射性同位素標記到非放射性標記。令人可喜的是，這一技術(shù)還處于不斷的改進和更新的過程中。
自1988年以來On等科學家相繼在研究對導致人類免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA進行細胞內(nèi)定位，以期提高對患者的陽性檢出率。在系列研究的基礎(chǔ)上，Bagasra及其同事在1990～1993年成功的報告了原位雜交及聚合酶鏈反應結(jié)合法，簡稱為原位雜交PCR（PCr in situ, PCRIS)。在本書二十二章 中曾介紹了PCR技術(shù)，它是一種對特www.med126.com定的DNA片段在體外進行快速擴增的無細胞克隆技術(shù)，基本步驟包括高溫變性，低溫退火適溫延伸三個步驟的反復熱循環(huán)，其效率可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增107～109倍。大大提高了DNA的檢測率。此法不足之外，在于其不能達到細胞或組織的定位。PCRIS技術(shù)的基本的原理是首先利用PCR技術(shù)將靶DNA片段擴增，然后用原位雜交細胞或免疫細胞化學技術(shù)通過標記的核酸探針與擴增了的DNA進行雜交顯示和定位，其敏感性可達到顯示單個拷貝基因的信號的程度。Bagasra及其同事們利用這一方法，應用32P和生物素標記的核酸探針分別對導致人體免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA的單個拷貝基因經(jīng)PCR擴增后在外周血單核細胞內(nèi)顯示成功。就算此法對HIV-1感染患者外周血單核細胞檢測的陽性率明顯高于用單純原位雜交技術(shù)的檢出率，說明其敏感度大于單純的原位雜交免疫細胞化學技術(shù)。其主要實驗步驟為將離心沉淀的細胞滴入覆有聚四氟乙烯（teflon coated)的設(shè)有三個凹孔的特制玻片（CellLine Associ－ates,Newfield, NJ ,Cat No 10～ 12,12～14mm的孔)的凹孔內(nèi)，加熱105℃90s，然后以2%多聚甲醛-磷酸緩沖液，pH7.4，固定1h，PBS漂洗3min×3。如用生物素標記核酸探針，應用0.3%的H2O2孵育37℃過夜，然后以蛋白酶K溶液（5μg/ml PBS)55℃孵育2h（孵育時間應根據(jù)細胞的種類而定)，將孵育的載片置于96℃熱板上2min，最終以蒸餾水漂洗，空氣干燥。在溶液中按PCR技術(shù)的需要加入20PM一對應的引物（Primer)，15μg PCR混合液含10μmol/l dATP、dCTP、dGTP和dTTP、50mmol/l KCl,10mmol/L Tris(pH8.3),2.5mmol/LMgCl2和10μl Taq多聚酶（lu/μl,Gene Amp Cetuo)。把上述溶液加入左側(cè)二孔中，留一孔加入無引物的PCR混合液作為對照。將載片以22×66mm蓋片覆蓋，片周以無色指甲油封閉，放入自動的熱循環(huán)儀（M.J.Re－seasCH,Boston MA)。可改良用鋁錫箔紙覆蓋于熱循環(huán)儀表面再放置載片。按94℃/45℃/72℃每f1411.cn/sanji/個溫度1min，30個循環(huán)。這溫度也可根據(jù)引物的GC比例加以調(diào)整以求得理想的擴增。也可根據(jù)下列公式計算引物的Tm值（Muller & Wold,1989)。
引物Tm=81.5 + 16.6(logM) + 0.41(%GC)–500/n
n=引物的長度，mol/L=緩沖液中鹽的摩爾數(shù)，一般是0.047mol./L
按擴增后，將切片放入100%乙醇3～5min，以銳利刀片移除蓋片，將載片放在90℃熱板上30s，應用2×SSC漂洗，然后用生物素標記核酸探針進行雜交。載片在95℃熱板上5min，然后移入溫盒，48℃孵育4h或過夜。次日PBS漂洗，以抗生物素標記FITC抗血清（100μg/ml PBS pH7.2)37℃孵育1h，PBS沖洗，以甘油/PBS溶液封片，熒光顯微鏡觀察。如生物素標記核酸探針的顯示系統(tǒng)為過氧化物酶，則應用DAB/H2O2溶液顯色，常規(guī)光鏡觀察。這一技術(shù)不僅提高了病毒HIV-1的偵檢率，而且可用以確定細胞內(nèi)攜帶的特殊基因，遺傳片段，病毒和腫瘤的侵犯（load)等，是一項頗具廣闊應用前景的實驗技術(shù)。
原位雜交免疫細胞化學技術(shù)存在的難點之一是實驗手續(xù)繁瑣，實驗周期長。國外Liesi等（1986)和國內(nèi)學者何彬等應用光敏生物素-鏈親合素（Biotin-streptavidin)膠體金系統(tǒng)進行原位雜交，得到了快速滿意的結(jié)果，全部實驗可在數(shù)小時內(nèi)完成。
作用把含某種多肽或蛋白的cDNA片段的質(zhì)粒，按照第十九章 在光照下標記光敏生物素，然后經(jīng)DNA酶消化1h，得到大量100～500bp長度的混合片段，變性后用于原位雜交。
如為培養(yǎng)細胞或細胞涂片，用95%乙醇、5%乙醇固定5min，PBS沖去固定液，加含探針的雜交液覆蓋（光敏生物素標記探針濃度為2.5ng/μl)，在溫盒中50℃孵育1～2h，取出后直接加入膠體金標記鏈親合素（1mg/ml)室溫孵育15min，然后在室溫或37℃下用大容量（200ml/每片)洗脫液（2×SSC，0.1%Triton X-100)分別沖洗5～10min，以銀顯影液放大金顆粒顯示原位雜交結(jié)果，可用1%伊紅復染，脫水，透明，封片，鏡檢。
如為冰凍切片（cryostat section 10～15μm)，應經(jīng)新鮮配制4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS沖去固定液，吸干后滴加蛋白酶K（25μg/ml,Sigma)37℃15min，再用4%多聚甲醛室溫固定20min，PBS沖去多聚甲醛，晾干后按上述方法進行原位雜交和雜交后沖洗。
原位啟動標記法（Primed in situ labelling,PRINS)，又叫寡核苷酸啟動法（Oligonucleotide－priming method)是Koch（1987)首先提出的，其基本原理是將未標記的寡核苷酸探針與細胞或組織中的靶DNA或RNA進行雜交，然后該寡核苷酸探針充當引物的作用，在Kelow多聚合酶的催化作用下，將生物素（或地高辛、熒光素)標記的核苷酸編入，以達到原位顯示的目的。PRINS技術(shù)具有3個方面的優(yōu)點：首先由于探針在雜交時是未標記的，僅在雜交之后才進行標記，因此背景染色很低。至少，從理論上講，背景染色幾乎是零。其次是有效地縮短了實驗的時間，由于探針未經(jīng)標記，無增加背景染色的顧慮。因此，可增加探針嘗試，縮短反應時間。雜交反應時間只需1h。實驗反應時間的縮短可有效的保持細胞或組織結(jié)構(gòu)的完整性。第三個優(yōu)點是能提高或增加信號的強度。Koch等曾成功的將此方法應用于染色體制片、單層細胞涂片和組織切片。它們還將此法與流式細胞計相結(jié)合以達到檢測群體離散細胞的目的。
在染色體或單層細胞涂片，載片在70℃的溶液中變性（70%甲酰胺，2×SSC)2min，立即在系統(tǒng)酒精中脫水（70%，80%，90%，95%,100%，V/V)，用吹風機吹干。預孵育在37℃～53℃20～30min，孵育時間加蓋玻片，孵育液含2～4pmol寡核苷酸探針，dATP，dCTP，dGTP各10mmol,5mmol生物素-11-dUTP在25μl×NT緩沖液中（1×NT緩沖液含50mmol/l Tris –HCl,pH7.2,10mmol/L MgSO4,100μM二硫蘇糖醇（dithio threitol),50μg/ml牛血清白蛋白)，在預孵育時加入1μl的Klenow多聚酶。應用100ml 50mmol/L EDTA, 50mmol/L NaCl在65℃洗1min 以終止反應，然后放入100ml×BN緩沖液（100mmol/l NaHCO3,Ph8.0,0.01%Nanidet P-40)40℃，進行檢測系統(tǒng)的顯示如熒光-親合素標記，過氧化物酶-親合素標記等。
總之，自Gall 和Pardue 1969年建立雜交免疫細胞化學以來的20余年中，已有不少新的改良的方法出現(xiàn)，但基本原則仍為Gall和Pardue所建立的相仿。作者個人體會是任何方法需在本人的實驗實踐中加以體驗和改良。比如目前對乙�；饔茫唇氪姿狒腿掖及肥欠衲軠p低背景染色的問題有作者對此提出異議。在科技工作者認為在原位雜交實驗的所有應用溶液中加入0.1%～0.2%的二乙基焦碳酸乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC)能有效的減低背景染色，但有些作者對此持懷疑態(tài)度。蛋白酶K的消化作用曾被認為是增加細胞或組織滲透性的關(guān)鍵步驟，但有作用在自身的實驗室實踐中體會除結(jié)構(gòu)較致密的組織如腦、脊髓等外，對培養(yǎng)或涂片的單層細胞、蛋白酶K的消化及預雜交均是可以省略的。本文列舉各作者的操作步驟略有不同，可能是基于這個原因。
目前，原位雜交技術(shù)主要應用于基因組圖（Gene mapping)，基因表達定位（localization of gene expression)，核DNA和RNA的排列，mRNA的排列和運輸（arrangement and transport of mRNA)，復制（replication)和細胞的分類（sorting of cells)。臨床研究應用在細胞遺傳學（Cytogenetics)，生前診斷（Prenatal diagnosis)，腫瘤和傳染性疾病的診斷，生物學劑量測定（biological dosimetry)和病毒學的病原學診斷等。隨著核酸探針的制備，標記方法和基本操作方法的不斷改進，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，相信在不久的將來，原位雜交化學技術(shù)將會更廣泛的被應用于各個學科，并不斷為生命科學提供新的資料，開拓新的領(lǐng)域。
