圓環(huán)病毒2型山東分離株全基因組的克隆與序列分析
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豬圓環(huán)病毒2型山東分離株全基因組的克隆與序列分析 摘 要：根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)全基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，從疑似斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)病料中擴(kuò)增出PCV-2基因組DNA，將基因片段克隆于pMD18-T載體，篩選獲得含有相應(yīng)片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T-PCV-2。對(duì)篩選出的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，PCV山東株的全基因組為1 767 bp，與國(guó)內(nèi)外毒株核苷酸同源性高達(dá)99.6%。關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；全基因組；克隆；序列分析豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是由Tischer等于1974年在PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，病毒粒子為20面體對(duì)稱，以滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制，可在PK-15細(xì)胞上生長(zhǎng)，但不引起細(xì)胞病變。該病毒屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員。圓環(huán)病毒科是國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第六次學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)新命名的一個(gè)科，其共同特征為病毒無(wú)囊膜，基因組由一個(gè)單股呈圓環(huán)狀的DNA鏈組成 。PCV為已知的最小的動(dòng)物病毒之一 ，PCV-1和PCV-2兩種血清型，兩者均不產(chǎn)生細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)。PCV-1無(wú)致病性，基因組為1 759 bp，包含7個(gè)閱讀框，廣泛存在于正常豬體各器官組織及豬源細(xì)胞。PCV-2基因組為1 768 bp，含有11個(gè)閱讀框，目前在GenBank上發(fā)表的各毒株的序列同源性在91.9%～100%之間，
氨基酸同源性在90.2%～100%之間，比較保守 。PCV-2是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，自1991年P(guān)MWS在北美最先發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在世界范圍內(nèi)流行 。其癥狀主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，貧血，呼吸困難，
黃疸等，病理變化主要為間質(zhì)性
肺炎，淋巴結(jié)炎，肝炎，腎病。更重要的是PCV-2在淋巴系統(tǒng)增殖可導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能下降 5- ，造成其他病毒性、細(xì)菌性疾病的并發(fā)或繼發(fā)，使病情加重。此外，PCV-2經(jīng)常與多種病原混合感染 ，使疾病復(fù)雜化。PMWS既可水平傳播，導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)病死亡；亦可垂直傳播，引起繁殖障礙 ，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV-2只存在一個(gè)基因型(genotype)，基因組序列相對(duì)穩(wěn)定，但分離自不同地區(qū)的毒株會(huì)有一定的差異 。由于現(xiàn)在主要應(yīng)用PCR等分子生物學(xué)方法診斷PCV-2感染及研究PCV-2的發(fā)病機(jī)制，因此需對(duì)不同地區(qū)來(lái)源的PCV-2毒株基因組序列有較詳細(xì)的認(rèn)識(shí)，以確定其基因序列變異程度，為建立有效的PCV研究方法奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，山東省也出現(xiàn)了與PCV-2相關(guān)的疾病病例，危害也在逐年增加。根據(jù)公開發(fā)表的PCV-2全基因組序列合成一對(duì)引物，用PCR方法從疑似病料中克隆得到PCV-2的全基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，探索PCV-2的變異規(guī)律，為該病毒的分子生物學(xué)、
流行病學(xué)、致病機(jī)理等相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 病料及試劑 病料來(lái)自山東某豬場(chǎng)疑似PMWS病死豬的組織(包括肺、淋巴結(jié)、肝以及腎)。pMD 18-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR試劑盒(包括ExTaq酶、dNTP Mixture、10×ExTaq buffer)、DL 2 000 Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐
青霉素(Amp)、X-Gal購(gòu)自Amresco公司，IPTG購(gòu)自Biosharp公司；宿主菌DH5α由本室保存；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。1.1.2 引物 引物1：5′-GAA CCG CGG GCT GGC TGA ACT TTT GAA AGT-3′；引物2：5′-GCA CCG CGG AAA TTT CTG ACA AAC GTT ACA-3′。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，為凍干粉，用前溶于滅菌的超純水中，稀釋至100 μmol/L，工作濃度為25 pmol/μL，置－20 ℃保存。1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、低溫高速離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)等。1.2 方法1.2.1 模板的制備 取0.5 mL離心病料上清，加入5 μL蛋白酶K，至終濃度為200 μg/mL，26.58 μL SDS(100 g/L)至終濃度為5 g/L,55 ℃水浴消化1.5 h，并不時(shí)搖動(dòng)使混勻。加入等體積的抽提液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)抽提一次，1 000 r/min離心10 min～15 min，小心吸取上層水相至新管，并向其中加入2倍體積的冷無(wú)水
乙醇和1/10倍體積的3 mol/L NaAc混勻，置－20 ℃冰箱過(guò)夜沉淀。12 000 r/min離心20 min，棄上清。用750 mL/L冷乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心3 min，棄上清。用干凈的吸水紙將殘留乙醇除去，干燥10 min～15 min，將管倒立于吸水紙上。取適量用作PCR模板。1.2.2 PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)體系中加入，10×ExTaq buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，DNA模板3 μL，ExTaq酶 0.25 μL，加滅菌水補(bǔ)至25 μL。1.2.3 PCR反應(yīng)條件 95 ℃預(yù)變性 9 min；94 ℃ 1 min ,65.1 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。取 5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查。1.2.4 PCR產(chǎn)物回收 取125 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，按說(shuō)明書操作，電泳鑒定回收的PCR產(chǎn)物。1.2.5 PCR產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化 將回收的PCR產(chǎn)物按照常規(guī)方法 連接到pMD 18-T載體上，轉(zhuǎn)化及提取質(zhì)粒。反應(yīng)體系為，pMD 18-T載體1 μL，Ligation solutionⅠ 5 μL，回收的PCR產(chǎn)物 4 μL。16 ℃水浴連接過(guò)夜。將上述連接產(chǎn)物加入到100 μL的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中2 min～3 min，加入800 μL LB培養(yǎng)液，混勻，37 ℃振蕩復(fù)蘇1 h，低速離心3 min，棄去部分上清，留下200 μL 即可。將其涂于含Amp(100 mg/mL)、IPTG(24 mg/mL)、X-Gal(20 mg/mL )的LB培養(yǎng)基上。置37 ℃培養(yǎng)箱，待液體吸收后，將平皿倒置過(guò)夜培養(yǎng)。1.2.6 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的篩選及鑒定 隨機(jī)挑取上述轉(zhuǎn)化平皿中的白色單菌落，接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過(guò)夜至培養(yǎng)液呈云霧狀，從菌液中提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆。1.2.7 序列分析 陽(yáng)性重組質(zhì)粒由寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序，并與其他毒株進(jìn)行同源性比較。2 結(jié)果2.1 PCR擴(kuò)增和菌液PCR鑒定結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外觀察，表明擴(kuò)增出了1 800 bp左右的特異性片段，與預(yù)期片斷大小相符。PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖1)顯示，在所設(shè)的4個(gè)退火溫度梯度下均擴(kuò)增出了目的條帶，且在退火溫度為65.1 ℃時(shí)，目的條帶最理想。因此，選定退火溫度為65.1 ℃。 2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接轉(zhuǎn)化后，隨機(jī)挑取11個(gè)單個(gè)白色菌落，過(guò)夜搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果顯示，所選11個(gè)單個(gè)白色菌落均為陽(yáng)性質(zhì)粒2.3 序列分析序列分析表明，PCV-2 SD株全長(zhǎng)1 767 bp，與資料報(bào)道相一致，包含分別與復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白Cap的ORF1和ORF2。應(yīng)用DNA Star將其與GenBank中的已知PCV-2全基因的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較。分析表明，所有PCV-2毒株之間同源性均很高(圖3)，介于96.2%～99.8%之間。本試驗(yàn)所測(cè)定的PCV-2 SD毒株與EF515839株同源性最高，達(dá)到99.6%。為了更好地了解PCV毒株的遺傳學(xué)特性及相互的親緣關(guān)系，在分析所有毒株同源性的基礎(chǔ)上繪制了系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(圖4)。從中可以看出，PCV-2分成兩個(gè)獨(dú)立的分支，EF619037自成一支，其余9株P(guān)CV-2關(guān)系密切，組成另一支。試驗(yàn)所測(cè)PCV-2 all與EF515839關(guān)系最為密切，同源性最高。 3 討論P(yáng)MWS是近10多年來(lái)出現(xiàn)的影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，PCV-2是引起該病的主要病原，但不是惟一病原，PCV-2-單獨(dú)感染可出現(xiàn)輕微的PMWS病變。用PCV-2與豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)同時(shí)感染仔豬可復(fù)制出典型的PMWS癥狀 10-1 。臨床上出現(xiàn)的PMWS病例多為PCV-2、PPV及PRRSV的混合感染。尤其是最近2年暴發(fā)的豬高致病性藍(lán)耳病(即高致病性豬繁殖與呼吸綜合征)，更是伴隨有PCV-2的感染。有研究表明，將PCV-2與PRRSV混合感染3周齡健康仔豬，出現(xiàn)了PRRSV單獨(dú)感染時(shí)所沒(méi)有的病變 1 。PCV-2是否是這次豬高致病性藍(lán)耳病暴發(fā)的幫兇，還有待于進(jìn)一步的研究。PCV-2是DNA病毒，且基因組較短，可直接通過(guò)PCR方法對(duì)疑似感染的病例組織樣品進(jìn)行核酸檢測(cè)。本研究以國(guó)內(nèi)地方疑似病料為模板，克隆得到了PCV-2 基因組，并測(cè)定了全序列，所測(cè)序列長(zhǎng)度為1 767 bp，避免了病毒分離時(shí)出現(xiàn)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力等不利因素。目前，PCV-2已在世界范圍內(nèi)廣泛存在，其全基因組大小有1 767 bp 和1 768 bp 兩種，對(duì)于這兩種基因長(zhǎng)度的PCV-2病毒，其毒力大小還有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)克隆得到的山東地區(qū)流行毒株與其他地區(qū)毒株的同源性均很高，與不同地區(qū)毒株之間的同源性最高可達(dá)99.8%，說(shuō)明所有PCV-2 之間親緣關(guān)系都很近，PCV-2在進(jìn)化上比較保守。雖然PCV在進(jìn)化上比較保守，但是引起的臨床疾病卻如此廣泛多樣，而且病毒也會(huì)隨著時(shí)間的推移逐漸發(fā)生變異。國(guó)外有相關(guān)報(bào)道，病毒在傳了120代過(guò)程中，發(fā)生了堿基的突變，使得病毒的復(fù)制能力提高 1 。病毒的變異會(huì)導(dǎo)致什么樣的結(jié)果，是否會(huì)使毒力改變，是否會(huì)使致病機(jī)制發(fā)生變化，至今為止，還沒(méi)有證據(jù)能夠證明不同PCV-2毒株相互間致病性有何差異 15-1 。PMWS 在臨床上缺乏特征性的表現(xiàn)， 除PCV外，還與其他病原發(fā)生混合感染， 對(duì)PCV-2毒株的基因組序列變化進(jìn)行分析， 有助于了解PCV-2毒株的致病特性和變異情況�；诖�，我們成功從疑似PMWS的病料中擴(kuò)增出了一株P(guān)CV-2的全部基因序列。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，PCV分成PCV-1及PCV-2兩個(gè)完全獨(dú)立的基因型。本試驗(yàn)所測(cè)毒株與EF515839親緣關(guān)系較近，處于同一分支內(nèi)，這為毒株的來(lái)源提供了一定的理論依據(jù)。本研究一次性擴(kuò)增出PCV-2全基因，為進(jìn)一步從分子水平研究PCV-2在山東省的流行情況，致病性，致病機(jī)理，毒力變化及主要結(jié)構(gòu)基因的特性等提供了科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果表明，目前我國(guó)PCV-2 毒株之間存在著一定的變異， 但是變異程度不大，這有利于進(jìn)一步開展我國(guó)PCV-2所引起疾病的預(yù)防和控制。
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