豬瘟診斷及防治
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豬瘟俗稱"爛腸瘟"是一種具有高度傳染性疫病，是威脅養(yǎng)豬業(yè)是主要的一種傳染病，其特征是：急性，呈敗血性變化，實(shí)質(zhì)器官出血，壞死和梗死；慢性呈纖維素性
壞死性腸炎，后期常有副
傷寒及巴氏桿菌病繼發(fā)�！ 。�1) 流行特點(diǎn)：本病在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和
野豬都易感，一年四季均可發(fā)生。病豬是主要傳染源，病豬排泄物和分泌物，病死豬和臟器及尸體、急宰病豬的血、肉、內(nèi)臟、廢水、廢料污染的飼料，飲水都可散播病毒，豬瘟的傳播主要通過(guò)接觸，經(jīng)消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母豬也可以經(jīng)胎盤垂直感染胎兒，產(chǎn)生弱仔豬、死胎、伊胎等�！ 。�2)潛伏期一般為5—7天，根據(jù)臨床癥狀可分為最急性、急性、慢性和溫和型四種類型�！ ：最急性型：病豬常無(wú)明顯癥狀，突然死亡，一般出現(xiàn)在初發(fā)病地區(qū)和流行初期。 B：急性型：病豬精神差，
發(fā)熱，體溫在40—42℃之間，呈現(xiàn)稽留熱，喜臥、弓背、寒顫及行走搖晃。食欲減退或廢絕，喜歡飲水，有的發(fā)生
嘔吐。
結(jié)膜發(fā)炎，流膿性分泌物，將上下眼瞼粘住，不能張開，鼻流膿性鼻液。初期
便秘，干硬的糞球表面附有大量白色的腸粘液，后期
腹瀉，糞便惡臭，帶有粘液或血液，病豬的鼻端、耳后根、腹部及四肢內(nèi)側(cè)的皮膚及齒齦、唇內(nèi)、肛門等處粘膜出現(xiàn)針尖狀出血點(diǎn)，指壓不退色，腹股溝淋巴結(jié)腫大。公豬包皮發(fā)炎，陰鞘積尿，用手?jǐn)D壓時(shí)有惡臭渾濁液體射出。小豬可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)磨牙、后退、轉(zhuǎn)圈、強(qiáng)直、側(cè)臥及游泳狀，甚至
昏迷等�！ ：慢性型：多由急性型轉(zhuǎn)變而來(lái)，體溫時(shí)高時(shí)低，食欲不振，便秘與腹瀉交替出現(xiàn)，逐漸消瘦、貧血，衰弱，被毛粗亂，行走時(shí)兩后肢搖晃無(wú)力，行走不穩(wěn)。有些病豬的耳尖、尾端和四肢下部成藍(lán)紫色或壞死、脫落，病程可長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月以上，最后衰弱死亡，死亡率極高。 D：溫和型：又稱非典型，主要發(fā)生較多的是斷奶后的仔豬及架子豬，表現(xiàn)癥狀輕微，不典型，病情緩和，病理變化不明顯，病程較長(zhǎng)體溫稽留在40℃左右，皮膚無(wú)出血小點(diǎn)，但有淤血和壞死，食欲時(shí)好時(shí)壞，糞便時(shí)干時(shí)稀，病豬十分瘦弱，致死率較高，也有耐過(guò)的，但生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻。 �。�3) 剖檢病變�！ 〖毙孕停喝砥つw、漿膜、粘膜和內(nèi)臟器官有不同程度的出血。全身淋巴結(jié)腫脹， 多汁、充血、出血、外表呈現(xiàn)紫黑色，切面如大
理石狀，腎臟色淡，皮質(zhì)有針尖至小米狀的出血點(diǎn)，脾臟有梗寒，以邊緣多見，呈色黑小紫塊，喉頭粘膜及扁
桃體出血。膀胱粘膜有散在的出血點(diǎn)。胃、腸粘膜呈卡他性炎癥。大腸的回
盲瓣處形成紐扣狀潰瘍�！ ÷孕停褐饕憩F(xiàn)為壞死性腸炎，全身性出血變化不明顯，由于鈣磷代謝的擾亂， 斷奶病豬可見肋骨末端和軟骨組織變界處，因骨化障礙而形成的黃色骨化線�！ 。�4) 實(shí)驗(yàn)室診斷：在口述診斷的基礎(chǔ)上，可用免疫熒光抗體檢查，酶標(biāo)記組織抗 原定位法，免體交互免疫試驗(yàn)，血清中和試驗(yàn)，豬瘟單克隆抗體純化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法之一進(jìn)行確診�！ 。�5) 防治措施 預(yù)防：A、免疫接種。B、開展免疫監(jiān)測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或正向間 接血凝試驗(yàn)等方法開展免疫抗體監(jiān)測(cè)。C、及時(shí)淘汰隱性感染帶毒種豬。D、堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出的飼養(yǎng)管理制度。E、做好豬場(chǎng)、豬舍的隔離、衛(wèi)生、消毒和殺蟲工作，減少豬瘟病毒的侵入�！ 。�6)疫情處理：A、立即報(bào)告，及時(shí)診斷。B、劃定疫點(diǎn)。C、封鎖疫點(diǎn)、疫區(qū)。D、處理病豬，做出無(wú)害化處理。E、緊急預(yù)防接種。疫區(qū)里的假定健康豬和受威脅地區(qū)的生豬即接種豬瘟免弱毒疫苗。F、消毒，認(rèn)真消毒被污染的場(chǎng)地、圈舍、用具等，糞便堆積發(fā)酵、無(wú)害化處理豬瘟(hog cholera，HC或SWliqe fever， sF) 治療進(jìn)展 在歐洲稱為古典豬瘟{classical swine fever．CSF)，是由豬瘟病毒(HCV或CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，豬是該病毒唯一的自然宿主。于1 833年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)俄亥俄州，百余年來(lái)其流行遍及全球。國(guó)際獸疫局將其定為A類傳染病，我國(guó)《動(dòng)物防疫法》將其列為一類傳染病．是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。中國(guó)豬瘟
兔化弱毒疫苗在防治豬瘟中曾起到?jīng)Q定性作用，但近幾年來(lái)出現(xiàn)免疫效果不理想．應(yīng)用組織培養(yǎng)弱毒苗也發(fā)生免疫失敗，究其原因比較多。由于豬瘟造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大．歷來(lái)是各國(guó)研究的熱點(diǎn)�！ �1 csFV基因結(jié)構(gòu)與功能的研究 CSFV為有囊膜病毒，40--60 nm，單股正鏈RNA。CSFV基因組長(zhǎng)約1 2 3 kb，僅含有一個(gè)大的開放性閱讀框架(ORF)．此ORF翻譯成含3898個(gè)
氨基酸殘基．分子量約438 kDa的多聚蛋白，并進(jìn)一步在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白．cSFV的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼。ORF兩側(cè)是5’一端非翻譯區(qū)(5’-UTR)和3’一端非翻譯區(qū)(3’-UTR)．且5’一端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)．3’一端無(wú)poly(A)尾巴。這一大前體蛋白以共翻譯和后翻譯的形式在細(xì)胞蛋白酶和病毒特異蛋白酶作用下．加工成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA上的編碼順序?yàn)镹pro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白外．其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白�！ ∧壳耙呀�(jīng)定位的CSFV蛋白有5種，即 Npro、c、Erns(E0)、E1和E2．它們均由CSFV的 RNA-ORF5’一端所編碼。在結(jié)構(gòu)蛋白中，最具有免疫防制研究?jī)r(jià)值的是EO和E2�！ �1.1 c,是病毒的衣殼蛋白，也稱p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267組成．是 CSFV核衣殼蛋白其N端由CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白p23的水解作用產(chǎn)生，c端可能是由宿主細(xì)胞的信號(hào)肽酶作用所致�！ �1．2 gp44／48，是病毒的一種囊膜糖蛋白．也稱Erns．舊稱E0。有9個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494組成。在感染細(xì)胞中g(shù)p44／48在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，并可存在于細(xì)胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中g(shù)p44／48以97KDa的同源二聚體形式存在于囊膜表面。由于其分子內(nèi)缺乏疏水的膜錨定區(qū)，與病毒囊膜結(jié)合力弱．易從囊膜上游離下來(lái)。gp44／48可誘導(dǎo)產(chǎn)生豬瘟的中和抗體．免疫豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)致死量CSFV的保護(hù)性免疫。由于編碼 gp44／48的核酸序列在屬內(nèi)比編碼gp55的序列保守程度高，因此E rns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白�！ rns具有RNase活性，作用于單鏈的 RNA．且對(duì)富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在體外即可將CSFV基因組RNA完全降解。推測(cè)Ems沒(méi)有將其自身RNA降解掉的原因可能是由于空間上的隔離。在宿主細(xì)胞中，新合成的E rns在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)．而其基因組RNA則在胞漿中：在病毒粒子中，定位于囊膜的Ems與其基因組RNA間隔著衣殼蛋白．因此E rns是不會(huì)降解其自身RNA的。編碼Ems的基因是瘟病毒屬病毒所特有的．黃病毒科中其他病毒基因組內(nèi)無(wú)此基因．推測(cè)該基因是病毒與宿主細(xì)胞的RNase基因重組得到的�！ �1．3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也稱E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95個(gè)氨基酸殘基(ORF編碼的Leu495至GlY68。組成，內(nèi)有3個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。其蛋白骨架中有兩段疏水序列(Leu548～ Pro579～Gly689)。在多聚蛋白轉(zhuǎn)位過(guò)程中，前一段是E1向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔轉(zhuǎn)位的終止信號(hào)，后一段則充當(dāng)E2轉(zhuǎn)位的信號(hào)肽，除此之外，這二段疏水區(qū)還充當(dāng)E1的膜錨定位點(diǎn)。E1在病毒囊膜內(nèi)．不能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生抗體�！ �1.4 gp55．為CSFV的另一囊膜糖蛋白，又稱為E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個(gè)病毒糖蛋白中保守性最低．最易變異的分子。gp55常以100kDa的同源二聚體及與gp33形成75kDa的異源二聚體形式存在于病毒粒子及CSFV感染的細(xì)胞表面。在體外gp55可誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的中和抗體，體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗CSFV的攻擊的抗體。 Hulst用20μg昆曳細(xì)胞表達(dá)的E2雙相油包水乳劑免疫豬，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株強(qiáng)毒的攻擊。gp55的蛋白骨架由370個(gè)氨基酸(ORF編碼的690-1060氨基酸殘基)組成．并以其c端的40個(gè)疏水氨基酸錨定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可為51-58kDa。E2分子內(nèi)的1 5個(gè)Cys殘基在屬內(nèi)均保守，其中N端6個(gè)Cys殘基參與抗原結(jié)構(gòu)域的形成，c端9個(gè)Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成�！ p 5 5的抗原決定區(qū)在其N端部分(ORF編碼的第690-866氨基酸)，可分為2個(gè)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單元，四個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域A．B．C，D。其中結(jié)構(gòu)域A又可分為A．， A2，A3三個(gè)亞域。結(jié)構(gòu)域B．c屬于一個(gè)結(jié)構(gòu)單元．均為中和抗體的結(jié)合位點(diǎn)．由 ORF編碼的690～800氨基酸殘基參與構(gòu)成。Cys693與CYS7377形成的二硫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)域 B、c的空間結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元含A．D抗原結(jié)構(gòu)域。A1、A2亞區(qū)定位于第795-851氨基酸殘基，在種內(nèi)保守A1是一個(gè)抗體的中和位點(diǎn)。亞區(qū)A3定位于766-813氨基酸殘基．而氨基酸殘基766-800則參與了結(jié)構(gòu)域D的構(gòu)成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828間的二硫鍵對(duì)這個(gè)結(jié)構(gòu)單元空問(wèn)結(jié)構(gòu)的形成是必需的。連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元的是一段屬內(nèi)保守的疏水序列．推測(cè)這段序列參與了病毒侵入細(xì)胞過(guò)程中的膜融合過(guò)程�！ �1.5 Npro，也稱p23，CSFV的非結(jié)構(gòu)蛋白，是ORF編碼的多聚蛋白N端的第一個(gè)蛋白質(zhì)。Npro由168個(gè)氨基酸組成．具有蛋白質(zhì)水解酶活性，能以自催化的方式從正在翻譯的多聚蛋白上斷裂下來(lái)，成為成熟的病毒蛋白。序列比較發(fā)現(xiàn)，編碼p2 3的基因在瘟病毒屬中是較為保守的。它的斷裂位點(diǎn)在Cysl 68與其下游的病毒核衣殼p1 4 N端第一個(gè)氨基酸ser。間。Npro的 cys69和His130可能位于其酶活性中心．能水解斷裂Cys與Ala及Gly與Ser間的肽鍵，斷列位點(diǎn)位于活性His殘基下游38個(gè)氨基酸殘基處。Npro不參與CSFV的結(jié)構(gòu)及非結(jié)構(gòu)蛋白的加工過(guò)程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖過(guò)程中的作用還不清楚。 Rumenapf等人使用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)參與 Npro催化活性的氨基酸殘基進(jìn)行測(cè)定．確定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸殘基，而 His130并非必須�！ �2實(shí)驗(yàn)窒診斷 目前豬瘟流行常常表現(xiàn)無(wú)規(guī)律的地區(qū)性散發(fā)．發(fā)病特征不典型，以發(fā)熱、精神沉郁、食欲減退、
咳嗽、共濟(jì)失調(diào)、結(jié)膜炎以及腹瀉、圍產(chǎn)期死亡、死胎、
流產(chǎn)。中等毒力及強(qiáng)毒感染有以上這些癥狀，并且在豬群中不分年齡快速傳播。結(jié)合這些臨床癥狀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷是必要的�！ �2.1 病毒抗原的檢測(cè)豬瘟病毒抗原的快速檢測(cè)對(duì)于豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前快速、敏感的檢測(cè)方法是利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)扁桃體組織。扁桃體中豬瘟病毒抗原可早在感染后2d檢測(cè)到．淋巴結(jié)、脾臟以及胰腺均可作為病毒早期檢測(cè)的組織樣品。Delas Mulas等及Narita等報(bào)道了一種檢測(cè)豬瘟病毒抗原的免疫組化方法．即利用針對(duì)E2糖蛋白的單克隆抗體檢測(cè)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品的免疫組化方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測(cè)長(zhǎng)期保存的樣品，缺點(diǎn)是較費(fèi)時(shí)．而且福爾馬林固定后的組織不能再進(jìn)行病毒分離。利用鏈酶一生物素一過(guò)氧化物酶(ABc)的免疫組化方法也能用于豬瘟病毒組織切片上抗原的檢測(cè)。據(jù)報(bào)道流式細(xì)胞儀也可進(jìn)行血樣中豬瘟病毒的檢測(cè)，但其敏感性較低。以豬瘟強(qiáng)毒感染仔豬，利用抗原捕獲ELISA方法檢測(cè)其病
毒血癥，結(jié)果表明該方法可用于豬群中
流行病學(xué)的調(diào)查。但其敏感性以及特異性均低于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法。 2.2 感染性病毒的檢測(cè)病毒分離是目前體外檢測(cè)感染性豬瘟病毒最特異的方法。已報(bào)道有幾種方法可以從組織、全血中分離病毒，白細(xì)胞是分離病毒的最佳樣品。然而一些研究人員發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞以及單核細(xì)胞在動(dòng)物感染后較長(zhǎng)時(shí)間才能感染病毒。因此，對(duì)于豬瘟的早期診斷．全血或血漿可能比白細(xì)胞更為敏感。最常用于豬瘟病毒分離的細(xì)胞為
豬腎細(xì)胞(PKl 5或SK6)或豬睪丸細(xì)胞(sT)。日本建立了一種豬腎由來(lái)的傳代細(xì)胞系(FS-L3)．FS-L3細(xì)胞在不感染病毒的情況下呈大園球狀．?dāng)?shù)倍至數(shù)十倍于普通細(xì)胞．但一旦感染了豬瘟病毒，F(xiàn)S-L3細(xì)胞的大園球狀即消失．這一特性已被用作豬瘟病毒的中和試驗(yàn)等各種生物學(xué)特性的測(cè)定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生細(xì)胞病變的毒株是因?yàn)樗倪z傳基因發(fā)生了變化。從5’末端的第一個(gè)核苷酸到4764個(gè)核苷酸均已缺失．其中包括5’末端的非編碼區(qū)、自身蛋白分解酶、衣殼蛋白、糖蛋白(E0、 E1、E2)、非結(jié)構(gòu)蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失�！ �2.3 豬瘟病毒基因組檢測(cè) 已報(bào)道利用RT-PCR方法檢測(cè)豬瘟病毒RNA有數(shù)種程序。瘟病毒屬特異的引物多選自基因組的5’端保守區(qū)．其最突出的優(yōu)點(diǎn)是其產(chǎn)物能用來(lái)直接測(cè)序，直接進(jìn)行病毒株的分型。一般來(lái)說(shuō)套式RT-PCR方法是檢測(cè)豬瘟病毒更敏感的方法，但其缺點(diǎn)是比較費(fèi)時(shí)．不適用于大量樣品的檢測(cè)。 McGoldrick等報(bào)道了一種檢測(cè)豬瘟病毒的單管熒光RT-PCR方法。此方法可檢測(cè)出仔
豬血樣中感染了中等毒力或高等毒力的豬瘟病毒，其敏感性高于病毒分離方法．并且簡(jiǎn)化了試驗(yàn)程序．減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)．還可進(jìn)行大量樣品的檢測(cè)。 2.4 抗體檢測(cè)最常用的檢測(cè)豬瘟病毒抗體的方法多以病毒中和試驗(yàn)為基礎(chǔ)。目前已建立數(shù)個(gè)特異的檢測(cè)血清抗體的E LlSA方法．包括檢測(cè)針對(duì)粗蛋白、特異結(jié)構(gòu)蛋白如E2、E rns以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3抗體的方法。目前使用最廣泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性與VNT相比為90％～99％．特異性為99％。Leforban等建立了一種ELISA方法，能夠區(qū)分BVDV、BDV以及 CSFV抗體。這個(gè)方法對(duì)于BVDV／BDV高流行地區(qū)(如荷蘭)csF的檢測(cè)非常有意義。ELISA特異性與敏感性的提高是目前面臨的最大的挑戰(zhàn)�！ ‘�(dāng)前，豬瘟仍是世界養(yǎng)豬業(yè)的一大威脅．1 997-1 999年期間在德國(guó)、荷蘭、西班牙和意大利等國(guó)都曾多次暴發(fā)了豬瘟，在我國(guó)CSFV的持續(xù)性感染和疫苗保護(hù)效力下降的現(xiàn)象也比較普遍，這不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且也給豬瘟防治政策的制定帶來(lái)了一定的困難。不過(guò)，相信隨著CSFV分子生物學(xué)和檢測(cè)方法研究的進(jìn)一步深入，這些問(wèn)題都會(huì)得到最終解決。
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