關于雛鴨
病毒性肝炎診斷問題
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鴨病毒性肝炎（duckvireshepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒（duckhepatitisvires，DHV)引起的雛鴨急性敗血性、高度致死性傳染病，其特征是患鴨呈現(xiàn)沉郁、轉圈、
抽搐、角弓反張等神經(jīng)癥狀，并具有肝臟腫脹、出血，膽囊充盈，膽汁顏色變淡等病理變化。鴨肝炎呈世界分布，其病原具有三個抗原性互不相關的血清型（血清Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型)。我國自1958年在上海發(fā)現(xiàn)本病至1996年前后，各地暴發(fā)與流行的鴨肝炎病原均屬于標準DHV-I型，其疫情可以被標準DHV-I型疫苗及抗體良好控制。1996年福建林世棠報道在福州地區(qū)發(fā)現(xiàn)不能被標準DHV-I型疫苗保護的鴨肝炎，1997年3月廣東珠江三角洲及其附近地區(qū)大面積暴發(fā)典型DVH，在使用傳統(tǒng)標準DHV-I型弱毒疫苗及其蛋黃抗體防制時，控制結果出現(xiàn)多樣性。部分疫情可以用標準DHV-I型高免蛋黃抗體控制，免疫保護率達95%以上;部分疫情用標準DHV-I型高免蛋黃抗體控制不力，往往需要重復注射抗體1～2次，免疫保護率在75%左右;部分疫情用標準DHV-I型高免蛋黃抗體控制的效果很差，發(fā)病死亡率在80%～90%，但使用本地分離強毒制備的高免蛋黃抗體或高免血清則可控制。珠江三角洲及其附近地區(qū)正在大面積流行DHV-I型鴨肝炎，其部分毒株的毒力有所增強，其抗原性發(fā)生了變異，使得所流行的DVH發(fā)病日齡、發(fā)病死亡率均有增大傾向，采用DHV-I標準毒株的弱毒疫苗或相應高免蛋黃抗體的防制效果出現(xiàn)多樣化，甚至常發(fā)生免疫失敗。因此，建立有效準確的診斷方法和防制對策對本病的預防有重大意義。 1 診斷 1.1 臨床診斷 本病主要感染3周齡以內的雛鴨，3～10日齡的雛鴨為高易感群體。潛伏期很短，為1～4天，雛鴨突然發(fā)病，開始時病鴨表現(xiàn)精神萎靡，不能隨群走動，眼睛半閉，
嗜睡。出現(xiàn)這些癥狀1～3h后表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，運動失調，身體倒向一側，雙腿作痙攣性運動，呈角弓反張姿態(tài)，俗稱"背脖病"。通常在出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后，十幾分鐘即死亡。有些發(fā)病急的病雛鴨往往突然倒斃，�？床坏饺魏伟Y狀。 1.2 病理變化 本病的主要病理變化是在肝臟。肝腫大，質脆，色暗或發(fā)黃，肝表面有大小不等的出血斑點。多數(shù)病鴨的腎臟發(fā)生出血和腫脹，膽囊腫脹。組織學變化的特征是肝細胞變性和壞死，部分肝細胞脂肪變性。 1.3 病毒分離 Ⅰ型鴨肝炎病毒分離可無菌采取雛鴨肝臟制成懸液，加氯仿，離心取上清液，經(jīng)尿囊腔接種8～10日齡雞胚或10～14日齡鴨胚，觀察胚體的病變和死亡情況，收集尿囊液。用病料或收獲的尿囊液經(jīng)肌肉接種易感雛鴨，經(jīng)24～48h死亡，若具有DVH的典型特征和癥狀，并且也能從死亡雛鴨中分離到病毒，即可證實此病。也可用直接熒光抗體技術在自然病例或接種鴨胚的肝臟上進行快速、準確的診斷。 Ⅱ型鴨肝炎病毒分離較困難，需要在雞胚尿囊腔內連續(xù)傳代。敏感雛鴨對Ⅱ型DVH攻擊的反應是多種多樣的。Ⅱ型鴨肝炎病毒最可靠的診斷方法是用電鏡觀察肝勻漿，檢出星狀病毒。 Ⅲ型鴨肝炎的檢測方法是對10日齡的鴨胚經(jīng)絨毛尿囊膜接種病料，觀察接種部位和胚胎的病變。 1.4 血清學方法 血清學方法包括用雞胚、鴨胚、雛鴨以及用細胞培養(yǎng)的病毒進行中和實驗、被動血凝實驗、間接血凝實驗、膠體金免疫電鏡技術、SPA協(xié)同凝集試驗，以及酶聯(lián)免疫吸附實驗等。 1.4.1 血凝實驗 孫泉云等粗提DHV經(jīng)Sephadex6200柱層析純化后作為致敏用抗原，
戊二醛法固定
綿羊紅細胞、BDB法致敏抗原紅細胞，建立了檢測DHV抗體的間接血凝試臉，其最佳致敏條件為：50%醛化紅細胞0.1ml，BDB2ml，DHV抗原0.5mg，37℃15min。本試驗還對不同
鴨血清的IHA抗體及免疫雛鴨的抗體水平等進行了檢測，經(jīng)與中和試驗比較，陽性結果符合率較高。 1.4.2 中和實驗 秦智鋒等將鴨病毒性肝炎病毒（ATCC株)用雞胚傳一代后，測出此病毒的雞胚半數(shù)致死量（ELD50)，通過多次重復試驗，建立了利用雞胚中和試驗和雛鴨中和試驗檢測鴨病毒性肝炎（DVH)的診斷方法。雛鴨中和試驗是在本體動物上進行試驗，靈敏度高，判斷準確。特別是鴨體本身的癥狀與病變對于確證該病非常有說服力。且與雞胚中和試驗相比，其所需周期短，操作相對簡單。但由于個體之間的差異，各個體之間相對抵抗力不同，所以重復性較差。雞胚中和試驗操作簡便，其死亡的胚體病變也具有特征性。但有些分離到的病毒不能初次就在雞胚上增殖，需
盲傳2～3代后方有特征性的病變。此外，雞胚試驗所需時限長，不能適應快速診斷的要求。 1.4.3 瓊脂免疫擴散 許偉琦等選擇接毒后48～72h死亡的含毒量最高峰時期的雞胚體作為抗原材料，通過反復研磨凍融和超聲波裂解使抗原成分充分暴露，并用氯仿抽提除去類脂質和雜蛋白，以PEG透析和硫酸銨沉淀法來濃縮和純化病毒，克服了非特異性反應，并在瓊脂糖板內加入2% PEG，大大加快沉淀反應，24h即能做結果判定，而且提高了沉淀線清晰度。 1.4.4 膠體金標記 程安春等用經(jīng)過初步提純的DHV制備的高免血清經(jīng)過非特異性吸收，同時對觀察用的病毒樣品及抗血清用前經(jīng)13000r/min處理，去掉一些雜質，使制備的免疫膠體金樣品在電鏡視野下基本看不到雜質，非常清晰，用膠體金免疫電鏡技術和直接電鏡（DEM)、免疫電鏡（IEM)比較觀察了鴨肝炎病毒，觀察到待檢病毒，免疫膠體金比DEM、IEM法清晰。視野中附著金顆粒的病毒量多，很容易就觀察到，而不像DEM和IEM那樣，由于背景雜質多，景像不清，病毒量少，鏡下尋找較困難。膠體金免疫電鏡技術是在免疫電鏡基礎上，加進在電鏡下具有強烈反差的金顆粒，故大大提高了檢測效果。膠體金免疫電鏡技術可用于檢測鴨病毒性肝炎病毒，具有簡便、快速、靈敏、直觀等特點，可作為快速檢測鴨病毒性肝炎病毒的常規(guī)方法。 張小飛等用膠體金標記提純后的
兔抗鴨肝炎病毒（DHV)IgG，建立了一種以微孔濾膜為固相載體，以紅色膠體金為標記物的檢測DHV的斑點免疫金滲濾法（DIC-FA)，并確定了最佳試驗條件。該法既可定性，亦可定量，其敏感性為抗原斑點試驗（AST)的2倍。特異性阻斷試驗和交叉反應試驗證明DIGFA檢測DHV具有較高的特異性。對DHV雞胚尿囊液DIGFA法檢出率為100%。DIGFA法是一種微量、敏感、特異、快速、簡便的檢測DHV方法。 1.4.5 SPA協(xié)同凝集試驗 SPA是大多數(shù)金色
葡萄球菌細胞壁上所含的一種主要成分。SPA能天然地和人類IgG分子Fc段結合的特點，克服了ELISA中酶標抗體或酶標抗體特異性的局限。酶標SPADotBlotlmmunoassay簡化了DHV的抗原、抗體的免疫檢測方法，對篩選DHV病毒的敏感細胞株和單克隆抗體的特異性檢測等，在特異性、重復性及定性、定量等諸多方面，都獲得了較滿意的效果。 1.4.6 ELISA診斷法 其優(yōu)點是靈敏度高，操作簡便，特異性強。 ELISA雙抗夾心法 陳溥言等建立了ELISA雙抗夾心法以檢測病毒，將其研制的單抗應用于病毒的檢測，能夠靈敏地檢測病毒樣品。 單抗捕捉法ELISA 孫泉云等將單抗的高度特異性與ELISA的高度靈敏性結合起來，建立了用以檢測DHV抗體的單抗捕捉法ELISA方法。該法能有效區(qū)分陰、陽性血清，非特異性背景很小。同時對抗原的純度要求也很低，甚至是尿囊液也能克服非特異性反應。 酶標Dot-ELISA 楊奎等采用過碘酸鈉法將
辣根過氧化物酶標記在純化的DHV上，建立了酶標Dot-ELISA法用于檢測DHV抗體。與以Polyvinyl板或Polystyrene為固相載體的ELISA法相比，酶標Dot-ELISA方法抗原用量少，很適于DHV這類難以提純的病毒的抗體的檢測。馬秀麗等采用過碘酸鈉法用辣根過氧化物酶標記純化的Ⅰ型鴨肝炎病毒單克隆抗體建立了檢測Ⅰ型鴨病毒性肝炎的Dot-ELISA方法。該方法簡便易行，特異性好，與鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、雞傳染性囊病病毒、雞新城疫病毒等無交叉反應，重復性高，對病毒尿囊液的最低檢出范圍為1∶16，而對肝臟病料的最低檢出范圍為1∶160。該方法可用于臨床發(fā)病鴨的檢測。 間接ELISA 楊萍萍等制備了雞抗DHV高免血清，并成功地用葡聚糖凝膠柱層析純化抗原包被酶標板，建立了檢測雞抗DHV血清抗體的間接ELISA方法，經(jīng)交叉試驗和阻斷試驗表明，該方法具有很高的敏感性和特異性，應用于DHV抗體檢測比較有效。 由于鴨肝炎病毒有多種血清型并且病毒難以分離和純化，至今沒見其他關于DVH的分子生物學診斷方法的報道。 2 防制措施 目前還沒有有效的化學藥物對雛鴨病毒性肝炎進行治療，因此該病重在免疫預防。 2.1 主動免疫 2.1.1 弱毒疫苗 程安春等將DHV通過雞胚連續(xù)傳代致弱而獲得疫苗株，對種鴨和雛鴨進行免疫。種鴨在收集種蛋前2～4周注射疫苗，雛鴨于3周內可獲得母源抗體保護，一般免疫期為6個月，5～6個月后應考慮第二次免疫;雛鴨在1日齡免疫弱毒疫苗，3～7天可產生免疫力，但母源抗體可影響效果，對有母源抗體的1日齡雛鴨采用口服免疫的效果優(yōu)于注射免疫。但由于某些地區(qū)出現(xiàn)Ⅰ型變異株疫情，用標準DHVI型弱毒疫苗或其抗體控制的效果呈現(xiàn)明顯的多樣性，部分基本可以控制，部分控制效果很差。這就是目前部分地區(qū)采用標準鴨肝炎Ⅰ型（DHV I型)的弱毒疫苗免疫效果不好的原因。 2.1.2 滅活疫苗 國內外有雞胚和鴨胚組織滅活苗，并證明鴨胚滅活苗比雞胚滅活苗效果好。但如果沒有弱毒苗的基礎免疫，只使用滅活苗的抗體效價很低。由于母源抗體的存在會影響免疫效果，因此沒有母源抗體的雛鴨才可以進行免疫。對存在母源抗體或情況不明的雛鴨可肌肉注射高免血清或蛋黃抗體進行預防。免疫效果除了受母源抗體的影響外，還受暴露于強毒的時間和嚴重程度的影響。如果雛鴨在出殼后早期暴露于強毒，特別是雛鴨病毒性肝炎呈地方性流行及嚴重感染的地區(qū)，其免疫效果也會降低。采用適當?shù)男l(wèi)生措施有助于解決這一問題。 2.1.3 二聯(lián)和多聯(lián)疫苗 陶淑珍等針對雛鴨的二種主要傳染病鴨漿膜炎、鴨病毒性肝炎制備的二聯(lián)滅活疫苗，免疫2周齡雛鴨;2周后攻毒鴨漿膜炎保護力達6/8上，鴨病毒性肝炎保護力達7/8以上;雛鴨免疫持續(xù)期可達12周以上，種鴨免疫后DHV抗體保護持續(xù)期1個月以上，并對疫苗的保存期進行試驗證明二聯(lián)滅活疫苗效果理想。 鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒二聯(lián)疫苗 張大丙等將雛鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒的雞胚弱毒分別免疫1日齡易感雛鴨，經(jīng)攻毒試驗和中和試驗，雛鴨5日齡時能分別抵抗各自強毒攻擊，說明這兩株弱毒在同一鴨體內都能迅速產生免疫力，互不干擾�？锅喐窝撞《镜目贵w消長規(guī)律、抗鴨瘟病毒強毒攻擊的保護情況分別與各自單苗一致。攻毒試驗還表明，二聯(lián)疫苗針對DPV的免疫期在2個月以上，也未受到DHV弱毒的影響，從抗體監(jiān)測結果看，二聯(lián)疫苗免疫雛鴨抗DHV中和抗體消長曲線與單苗情況也一致，因而針對DHV的免疫期也未受到DPV弱毒"的干擾。野外實驗亦表明，DHV、DPV兩株弱毒同時免疫也可以獲得分別免疫單苗的效果。結果表明，分屬于兩個病毒科的DHV、DPV弱毒進入同一鴨體互不干擾對方的增殖并至少在2個月內互不干擾對方的免疫力的產生和維持。 程安春等對鴨瘟一鴨病毒性肝炎二聯(lián)疫苗的配比、穩(wěn)定性、保護條件、保存期、攻毒試驗、免疫后抗體消長規(guī)律及二聯(lián)疫苗的田間試驗、免疫途徑等進行了比較全面的研究，也證明了二聯(lián)苗免疫成鴨的效果與各自單苗基本一致。 2.2 被動免疫 采用出殼鴨苗于24～28h內注射鴨病毒性肝炎蛋黃液，配合人用乙肝
中草藥劑效果尤佳，可獲100%保護�？祻网喲搴透呙庋逯卸己心苤泻筒《镜目贵w，可用于治療病鴨或用于被動免疫，效果良好。 用雞接種鴨DVH病毒油劑滅活疫苗，強化免疫，能獲得相應特異性蛋黃抗體，防治鴨DVH病具有良好的效果，也能避免應用同源蛋黃液可能帶來的疫病傳播。 據(jù)國外研究報道，不同血清型病毒在血清學上有著明顯的差異，無交叉免疫性。因此，雛鴨發(fā)病后，即使使用高免血清或高免蛋黃也不一定產生良好的效果，如果是同一血清型效果肯定好。而注射高免血清或蛋黃次數(shù)及注射后能產生多大保護率尚沒有確切的數(shù)據(jù)，臨床使用時可根據(jù)病情而定。 另外，四川農業(yè)大學禽病防治研究中心已研制出抗鴨病毒性肝炎二價（Ⅰ＋Ⅲ型)高免抗體，1日齡雛鴨皮下注射1m1即可有效預防Ⅰ型和Ⅲ型雛鴨病毒性肝炎，治療劑量2～3ml/只，具有良好效果。對種鴨可在開產前15～30天進行1～2次免疫，可保護下一代雛鴨不患Ⅰ型和Ⅲ型雛鴨病毒性肝炎。 2.3 中草藥 中草藥的作用在于，調理機體的氣血，疏肝理脾，調整機體的代謝功能和免疫功能。順克巧等用
茵陳、
龍膽草、
黃芩、
黃柏、
梔子、
柴胡、
板藍根、雙花、
防風等疏肝理氣、調整氣血、清熱解毒等中草藥，治療鴨病毒性肝炎。整個試驗觀察5天，死亡率為5.37%，比抗體對照組、空白對照組的死亡率分別低6%和近57%。祝建新等用自配的"鴨肝散"制劑（茵陳、龍
膽草、黃芩、黃柏、
金銀花、板藍根、梔子、柴胡、防風、
鉤藤、
神曲、
荊芥、
甘草等13味中藥經(jīng)炮制按比例混合后煎熬兩次，煎液合并濃縮至含生藥0.5g/m1)治療鴨病毒性肝炎，其效果與高免蛋黃抗體相當，而且不易復發(fā)。
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