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動物生化學重要技術(shù)(層析技術(shù))

來源:本站原創(chuàng) 更新:2011-11-24 執(zhí)業(yè)獸醫(yī)考試論壇



五 凝膠層析
(一)原理
凝膠層析是20世紀60年代發(fā)展起來的一種分離分析方法。其法有許多同義詞,如凝膠過濾、分子篩過濾、凝膠滲透層析等。
凝膠層析是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術(shù)。凝膠的孔隙猶如“篩眼”。當被分離的物質(zhì)流過凝膠柱時,分子大于凝膠“篩眼”范圍的物質(zhì)完全被排阻,不能進入凝膠顆粒內(nèi)部,只能隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動,因此受到的阻滯作用小,流程短,流速快而先流出層析柱;分子小于“篩眼”的物質(zhì)則可完全滲入凝膠顆粒的“篩眼”中。因此,受到的阻滯作用大,而且從一個顆粒的“篩眼”又進入另一顆粒的“篩眼”,其流程長,流速也就慢,從層析柱中流出就較晚。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質(zhì),則居二者之間從柱中流出。f1411.cn從流出先后次序的不同即可達到分離和純化被分離物質(zhì)的目的。
凝膠的這種特性又稱分子篩效應。洗脫時峰的位置和該物質(zhì)相對分子質(zhì)量有直接的定量關系。在一根凝膠柱中,顆粒間自由空間所含溶液的體積稱為外水體積Vo,不能進入凝膠孔徑的那些大分子,當洗脫體積為Vo時,出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積稱為內(nèi)水體積Vi,能全部透入凝膠的那些小分子,當洗脫體積為Vo+Vi時出現(xiàn)洗脫峰,介于其間的分子將在洗脫體積為Vo+Ve時,出現(xiàn)洗脫峰。
我們將分子篩分配系數(shù)定義為:K=Ve/Vi
若生物大分子的分子為球形,其K與生物大分子的相對分子質(zhì)量Mr存在如下關系:
K=-blgMr+c
其中b和c為常數(shù)。實驗已證實這一關系的存在。
(二)凝膠的種類
用作凝膠的載體物質(zhì)有交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺和瓊脂糖。
1、交聯(lián)葡聚糖凝膠
交聯(lián)葡聚糖商品名為Sephadex,它的原料是細菌分泌的鏈狀葡聚糖。通過交聯(lián)劑1-氯代-2,3-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。交聯(lián)劑添加越多,孔徑越小,吸水量也就越;反之越大。商品Sephadex以G值表示不同交聯(lián)度,G值越大,空穴也越大,G后邊的數(shù)字表示每克干膠膨脹時吸水量的10倍,G-25表示每克干膠可吸附2.5g水。
一般將SephadexG-10至G-50的凝膠稱為硬膠,因其吸水量比較;而SephadexG-75、G-200由于吸水量大,膨脹度較大,稱之為軟膠。
層析時選用何種凝膠,需根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小及分離目的不同而決定。一般把用于小分子物質(zhì)如無機鹽從有機大分子中分離出來的層析,多使用“篩眼”小的凝膠如SephadexG-10至G-50;分離分子大于10 000以上的兩種分子大小近似的物質(zhì)時,使用“篩眼”大的G-75以上的凝膠。
凝膠基本上是一種不帶電荷的球狀物質(zhì)。本身不會與被分離的物質(zhì)相互作用,所以分離效果好。但葡聚糖凝膠分子上含有的羥基,能與某些蛋白質(zhì)的堿性基團相互作用,吸附少量蛋白質(zhì)。為此,在洗脫時可在洗脫液中加入氯化鈉等中性鹽,提高離子強度,當離子強度大于0.05時即可克服這種吸附。
2.聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺和N,N′-次甲基二丙烯酰胺聚合而成。其商品名為生物膠P(Bio-GelP)。其孔穴大小也是隨交聯(lián)增多而減少,并用P值表示不同的交聯(lián)度。P值越大,孔徑也越大。
3.瓊脂糖凝膠
瓊脂糖是從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性組分。它是D-半乳糖和3,6-脫水L-半乳糖相間重復結(jié)合而成的鏈狀化合物。
這種糖鏈依靠糖基之間的氫鍵作用,形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠改變瓊脂糖濃度的方法來控制,因此商品也是以含水狀態(tài)供應。因為瓊脂糖凝膠靠的是氫鍵相交聯(lián),一般型號只能在0~40℃以及Ph4~9范圍內(nèi)使用。近年,應用交聯(lián)劑制備得到的cl型和FF型瓊脂糖則有比較好的穩(wěn)定性,能用于濃脲、胍、有機溶劑及非離子型去污劑溶液,還能經(jīng)受110~120℃高壓滅菌處理,對生物大分子的吸附能力也特別低。無論是哪種瓊脂糖凝膠,其機械強度都比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠好得多,同時它對生物大分子等高分子的吸附作用也小得多。另外,瓊脂糖凝膠適用相對分子質(zhì)量的范圍寬,最大可以到108,這一點是另外兩種凝膠所無法達到的。正由于以上這些優(yōu)點,它的應用受到人們的重視。瓊脂糖的商品名為Sepharose或Bio-GelA。
(三)操作方法
1、凝膠的處理 為了獲得合適的流速和良好的分離,凝膠粒子在使用前需經(jīng)一定處理,主要是將凝膠的保存液更換到分離蛋白質(zhì)的洗脫液中,對于Sephadex系列凝膠在使用前需充分的膨脹與浮選。
2、裝柱 取適當長度的色譜柱(G-200選用2.5cm×100cm),底部鋪上尼龍篩網(wǎng)或玻璃絲,以不漏粒子為準。用緩沖液(如PBS)飽和凝膠粒子,置室溫1h后上柱。自頂端傾注凝膠懸浮液時,應沿直插到管底的玻璃棒緩緩流入,以免產(chǎn)生氣泡與漏出粒子。為了防止分層,最好將凝膠懸液放于貯液瓶中,連續(xù)加入。
3、柱填充的檢查和Vo的測定 檢查柱子填充是否正確的最好方法是用此柱分離某些有色物質(zhì)。藍色葡聚糖-2 000是常用的一種物質(zhì),它是一種高分子葡聚糖,含有藍色發(fā)色基團,因此可在一次操作中檢查柱子的填充狀況和測定出滯留容量Vo。方法是把0.2%的藍色葡聚糖-2 000溶液(1/50~1/100柱床體積)加到柱子上,洗脫液的離子強度應為0.02或更高。在色譜分離過程中,可能出現(xiàn)的色帶形狀。柱子填充良好是獲得好的分離結(jié)果所必需的。如果用藍色葡聚糖進行實驗后獲得了一個不好的色譜帶,那么就說明凝膠床沒有填好。在這種情況下,柱子必須重新裝填。
4、加樣 在加樣時,為了不擾亂凝膠表面,可在頂部放上一層圓形濾紙或尼龍網(wǎng),也可覆蓋一層SephadexG-25(5mm厚)的凝膠。樣品要有一定的濃度和體積。通常為床柱體積的1%~10%,濃度不宜超過1%~4%。
5、洗脫 洗脫劑多采用低離子強度的鹽溶液。f1411.cn各種類型凝膠對流速要求不一。
6、再生 樣品洗脫完畢后,凝膠柱即已再生。一次裝柱,可反復使用多次。因此操作簡便,重復性高。
7、保存 各型凝膠懸液加防腐劑或滅菌后,可置冰箱保存數(shù)月。防腐劑類型很多,最常用的有0.02%的疊氮化鈉與0.05%的柳硫汞等,也可用高壓蒸汽0.1MPa 30min滅菌。
(四)應用
凝膠層析是一種快速、簡便的分離分析技術(shù)。由于設備簡單,操作方便,不需有機溶劑,對高分子物質(zhì)有很高的分離效果,廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、激素、抗生的素、生物堿等物質(zhì)的分離和提純,也可用于蛋白質(zhì)溶液的脫鹽及高分子溶液的濃縮、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定等。


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