二 醋酸纖維薄膜電泳
醋酸纖維薄膜(CAM)是一種由醋酸纖維加工制成的一種細密且薄的微孔膜。根據其乙;潭、厚度、孔徑和網狀結構等方面不同而具有不同類型,F已廣泛應用于各種生物分子的分離分析中,如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、類固醇及同工酶等。它具有簡單快速等優(yōu)點:①電泳區(qū)帶界限清晰;②通電時間較短(20min至1h);③對各種蛋白質基本無吸附,因此無拖尾現象;④不吸附染料,因此薄膜上未與蛋白質結合的染料可完全洗掉,顯示電泳區(qū)帶背景干凈。電泳須在密閉容器中使用較低電流進行,因薄膜吸水量較低,可避免過分蒸發(fā)。其電滲作用雖高但很均一,不影響樣品分離效果。不足之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低,由于薄膜厚度。s10~100μm),樣品用量很少,不適于制備。
影響電泳的因素:①膜的性質;②緩沖溶液的組成,pH值和濃度;③電流和有效電壓;④電泳時間和溫度;⑤電泳槽的密封性能。
操作步驟:點樣→電泳→染色→漂洗→透明→測定吸光度。
選用一定長度和寬度的薄膜條,在其一端處點上樣品,在一定電壓、電泳條件下,進行電泳。染色可根據不同物質使用不同的顯色方法,如核苷酸等物質可在紫外分析燈下觀察定位。染色漂洗后,可將電泳區(qū)帶剪下,溶于一定溶液中進行吸光度測定,也可浸于折射率為1.474的油中或其他透明液中使之透明,然后直接用吸光度計測定。
?電泳結果不滿意或失敗的可能原因有:①醋酸纖維素薄膜過分干燥出現白斑、膜彎曲、表面緩沖液過多;②緩沖溶液濃度過高或使用次數太多,時間過長而改變濃度;③樣品量太多、加樣不整齊、起始位置錯誤;④電泳時間過長或過短、電泳槽密閉性不好、電流太大、溫度過高;⑤染色液連續(xù)使用次數過多,pH值改變。
三 瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的,是由D-半乳糖和3、6-脫水-L-半乳糖結合的鏈狀多糖,含硫酸根比瓊脂少,因而分離效果明顯提高。
瓊脂糖電泳具有以下優(yōu)點:①瓊脂糖含液體量大,可達98%~99%,近似自由電泳,但樣品的擴散度比自由電泳小,對蛋白質的吸附極微;②瓊脂糖作為支持體有均勻、區(qū)帶整齊、分辨率高重復性好等優(yōu)點;③電泳速度快;④透明而不吸收紫外線,可以直接用紫外檢測儀作定量測定;⑤區(qū)帶可染色,樣品易回收,有利于制備。缺點是瓊脂糖中有較多硫酸根,電滲作用大。
緩沖液的選用:瓊脂糖電泳常用緩沖液的pH在6~9之間,離子強度為0.02~0.05。離子強度過高時,會有大量電流通過凝膠而產生熱量,使凝膠水分蒸發(fā),析出鹽結晶。嚴重可使凝膠斷裂,電流中斷。常用緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。為防止電泳時兩極緩沖液槽內pH和離子強度改變,可在每次電泳后合并兩極槽內的緩沖液混勻后再使用。
瓊脂糖電泳常用于抗原抗體反應的分析,抗體的分離。其種類較多,如高壓瓊脂糖免疫電泳,定量免疫電泳(火箭免疫電泳,雙向免疫電泳)等。
四 聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳,這種凝膠由丙烯酰胺,簡稱Acr和交聯劑N,N′-甲叉基(亞甲基)雙丙烯酰胺,簡稱Bis聚合而成。
聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好,彈性大,透明,化學穩(wěn)定性高,無電滲作用,設備簡單,用樣量少(1-100μg)和分辨率高等優(yōu)點。并可通過控制單體濃度或單體與交聯劑的比例聚合成孔徑大小不同的凝膠,可用于蛋白質、核酸等物質的分離、定性和定量分析。
還可結合去垢劑十二烷基硫酸鈉(SDS),以測定蛋白質亞基分子量。
根據凝膠形狀可分為盤狀電泳和板狀電泳。盤狀電泳是在直立的玻璃管內,利用不連續(xù)的緩沖液的pH值進行電泳,同時,由于樣品混合物被分開后形成的區(qū)帶非常窄,呈圓盤狀,故而得名。板狀電泳(垂直或水平)是將丙烯酰胺聚合成方形或長方形平板狀,平板大小和厚度視實驗需要而定。垂直平板電泳有如下優(yōu)點:①表面積大,易于冷卻,便于控制溫度;②能在同一凝膠板上,相同操作條件下,同時點加多個樣品,便于相互比較;③一個樣品在第一次電泳后,可將平板轉90度進行第二次電泳即雙向電泳;④便于用各種方法鑒定(如放射自顯影等)。其缺點是制備凝膠時操作較復雜,電壓較高,電泳時間較長。