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二 分光光度計結構簡介
能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來，并測量其強度的儀器稱為分光光度計。
分光光度計因使用的波長范圍不同而分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段)光光度計等。無論哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測系統(tǒng)。
(一)光源
一個良好的光源要求具備發(fā)光強度高，光亮，穩(wěn)定，光譜范圍較寬和使用壽命長等特點。分光光度計上常用的光源有鎢燈和氫燈（或氘燈)，前者適用于340～900nm范圍的光源，后者適宜于200～360nm的紫外光區(qū)，為了使發(fā)出的光線穩(wěn)定，光源的供電需要由穩(wěn)壓電源供給。
(二)單色器
單色器是將混合光波分解為單一波長光的裝置，多用棱鏡或光柵作為色散元件，它們能在較寬光譜范圍內(nèi)分離出相對純波長的光線，通過此色散系統(tǒng)可根據(jù)需要選擇一定波長范圍的單色光，單色光的波長范圍愈狹，儀器的靈敏性愈高，測量的結果愈可靠。
(三)狹縫
狹縫是由一對隔板在光通路上形成的縫隙，通過調(diào)節(jié)縫隙的大小調(diào)節(jié)入射光的強度，并使入射光形成平行光線，以適應檢測器的需要。分光光度計的縫隙大小是可調(diào)的。
(四)比色杯
比色杯也叫樣品池、吸收器或比色皿，用來盛測定溶液，各個杯子壁厚度等規(guī)格應盡可能完全相等，否則將產(chǎn)生測定誤差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)，在紫外光區(qū)測定時要用石英比色杯。
(五)檢測系統(tǒng)
有許多金屬能在光的照射下產(chǎn)生電流，光愈強電流愈大，此即光電效應。因光照射而產(chǎn)生的電流叫做光電流。受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產(chǎn)生的電流較強，可直接用微電流計量出。但是，當連續(xù)照射一段時間后會產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象而使光電流下降，要在暗中放置一段時間才能恢復。因此使用時不宜長期照射，隨用隨關，以防止光電池因疲勞而產(chǎn)生誤差。光電管裝有一個陰極和一個陽極，陰極是用對光敏感的金屬（多為堿土金屬的氧化物)做成，當光射到陰極且達到一定能量時，金屬原子中的電子發(fā)射出來。光愈強，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負電的，被吸引到陽極上而產(chǎn)生電流。光電管產(chǎn)生電流很小，所以需要放大。分光光度計中常用電子倍增光電管，在光照射下產(chǎn)生的電流比其他光電管要大得多，這就提高了測定的靈敏度。檢測器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)字的結果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計算機聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等進行。
三 分光光度技術的應用
(一)測定溶液中物質(zhì)的含量
利用分光光度法對物質(zhì)進行定量測定的方法，主要有以下幾種：
１．直接比較法（標準管法) 可見或紫外分光光度法都可用于測定溶液中物質(zhì)的含量。這需要測定標準溶液（濃度已知的溶液)和未知液（濃度待測定的溶液)的吸光度，將兩者進行比較。由于所用的吸收池的厚度是一樣的，可用下式進行計算。
C測=A測/A標×C標
式中C測代表未知液的濃度，C標代表標準液的濃度，A測和A標分別代表未知液和標準液所測得的吸光度值，式中只有是C測未知的，可由上式計算得之。
含量測定時通常要選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長，這樣做有兩個好處：①靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；②可以避免其他物質(zhì)的干擾。
２．標準曲線法（適合成批試樣分析) 用已知濃度的標準溶液，配制成一系列不同濃度的標準溶液，在最大吸收波長（λmax)處測得各個吸光度（Ａ值)，以Ａ為縱坐標，濃度為橫坐標，作標準曲線，（繪制A-C曲線)取其直線部分作定量依據(jù)。在測定被測樣品時，以相同條件在λmax處測定A值，再從標準曲線上查得該樣品的相應濃度。
標準曲線制作與樣品管的測定，應在同一儀器上進行，在配制樣品時，一般選擇其濃度相當于標準曲線中部的濃度較好。
在實驗條件比較恒定，樣品數(shù)量多的測定中，標準曲線法是十分方便準確的。但繪制好的標準曲線僅供在同樣條件下處理的被測溶液使用。因為測定值與標準曲線之間會因儀器性能、試劑的批號及溫度、時間等不同而有所變化。為此，標準曲線要經(jīng)常檢查校正。其方法是配制的已知濃度的標準液，按原標準曲線的處理顯色，測得吸光度值，然后比較由標準曲線查出的濃度與已知濃度差值，若差值在實驗要求的允許范圍內(nèi)，標準曲線仍可使用，超出則需要重新繪制。為校正的方便，標準曲線繪制完畢后，應在坐標紙上注明測定內(nèi)容，儀器型號和波長，繪制日期等。
(二)用紫外光譜鑒定化合物
使用分光光度計可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制吸光度—波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。
各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質(zhì)種類的鑒定。當一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線形狀一樣時，則很可能它們是同一物質(zhì)。一定物質(zhì)在不同濃度時，其吸收光譜曲線中峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低谷的波長是一定不變的。
紫外光吸收是由不飽和的結構造成的，含有雙鍵的化合物能表現(xiàn)出吸收峰。同一種物質(zhì)的紫外光吸收光譜應完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結構不一定相同。除了特殊情況處，單獨依靠紫外光吸收光譜不能決定一個未知物的結構，必須與其他方法配合。紫外光吸收光譜分析主要用于已知物質(zhì)的定量分析和純度分析。
