| 公開(公告)號 | CN100349921C |
| 公開(公告)日 | 2007.11.21 |
| 申請(專利)號 | CN200510096372.X |
| 申請日期 | 2005.11.17 |
| 專利名稱 | 破傷風毒素T細胞表位多肽與人B淋巴細胞刺激因子融合蛋白及其制備 |
| 主分類號 | C07K19/00(2006.01)I |
| 分類號 | C07K19/00(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 張英起;薛曉暢;顏 真;趙 寧 |
| 地址 | 710032陜西省西安市長樂西路17號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 西安通大專利代理有限責任公司 |
| 代理人 | 李鄭建 |
| 國省代碼 | 陜西;61 |
| 主權(quán)項 | 一種破傷風毒素T細胞表位多肽與人B淋巴細胞刺激因子融合蛋白TT-BLyS的制備方法，其特征在于按以下步驟進行： 1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ①TT表位肽基因的克隆 編碼TT830-843的在這對寡核苷酸片段的5’端引入了EcoRI酶切位點，3’端引入了BamHI酶切位點： S15’-AATTCATGCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACTGAAG-3’ S25’-GATCCTTCAGTGATACCGATGAATTTGGAGTTAGCTTTGATGTACTGCATG-3’ 取等量S1和S2，煮沸5分鐘，自然冷卻至室溫，進行退火；克隆載體pGEM-3Zf(-)經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切并回收大片段；TT的退火產(chǎn)物與載體酶切后回收的大片段經(jīng)T4連接酶進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進行雙酶切和DNA序列測定進行鑒定； ②人B淋巴細胞刺激因子和TT融合基因克隆載體的構(gòu)建 通過PCR反應(yīng)獲得人BLyS基因，同時將BamHI酶切位點引入5’端引物，PstI酶切位點引入3’端引物；引物序列如下： P1(5’端引物31nt)5’-GCGGGATCCATGGCCGTTCAGGGTCCAGAAG-3’ P2(3’端引物31nt)5’-GCGCTGCAGTCACAGCAGTTTCAATGCACCA-3’ 對人白細胞cDNA文庫進行PCR擴增；PCR擴增反應(yīng)管的配制均在冰浴中進行，PCR反應(yīng)體系為：不含有Mg2+的10×PCRbuffer5μL，2.5mmol/LdNTP4μL，引物各1μL，25mmol/LMgCl23μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶1μL，加水至總體積50μL；PCR反應(yīng)條件：94℃1min，52℃45s，72℃1min，共30次循環(huán)；最后，72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期大小的DNA片段； 質(zhì)粒pGEM-3Zf(-)-TT經(jīng)BamHI和PstI雙酶切后回收大片段，回收的片段與上述的PCR產(chǎn)物經(jīng)同樣雙酶切的回收產(chǎn)物進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定獲得預(yù)期大小的插入片段，進行測序，結(jié)果與預(yù)期一致； 2)原核表達載體的構(gòu)建及重組蛋白表達 質(zhì)粒pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS經(jīng)EcoRI和PstI雙酶切后回收小片段，原核非融合表達載體pKKH也經(jīng)上述同樣的雙酶切后回收大片段，兩者進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒命名為pKKH-TT-BLyS，將含有重組質(zhì)粒pKKH-TT-BLyS的大腸桿菌DH5α于37℃置入LB培養(yǎng)基中活化振搖培養(yǎng)過夜，次日清晨，按1∶100的比例接種于LB培養(yǎng)基中后，繼續(xù)37℃培養(yǎng)3h至對數(shù)生長后期，OD650nm＝0.4時，加入1mMIPTG，培養(yǎng)4h，收集菌體；超聲裂菌后，離心收集包涵體； 3)表達產(chǎn)物的鑒定 對表達產(chǎn)物的鑒定采用Westernblot鑒定，檢測其與BLyS單抗的反應(yīng)特異性，步驟如下： ①pKKH-TT-BLyS/DH5α誘導(dǎo)后裂菌產(chǎn)物進行SDS-PAGE； ②電泳分離后，按照Bio-Rad產(chǎn)品說明，將凝膠靠近陰極一側(cè)、硝酸纖維素膜靠近陽極一側(cè)，在預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液中100V恒壓1小時電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上； ③電泳結(jié)束后，取出NC膜，洗滌液TBST清洗后浸入含有2％BSA的TBST中37℃1小時，TBST室溫洗3次，5min/次，加入羊抗人BLyS抗體，37℃孵育1小時，TBST洗3次，加入兔抗羊IgG-AP，37℃孵育1小時，TBST洗3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入顯色液中，室溫避光顯色適當時間，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；觀察誘導(dǎo)產(chǎn)物與BLyS抗體的特異性反應(yīng)； 同時，對純化產(chǎn)物進行N-末端氨基酸測序，方法為：純化的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，R-250染色，脫色后用Edman降解法在492型ProciseTMcLC蛋白測序儀上分析N端氨基酸序列； 4)重組蛋白的純化 每1克菌體加5ml裂菌緩沖液，兩者混合后的體積為V，將菌體重懸，裂菌緩沖液的配方為：0.1mol/LTris，pH7.0；1mmol/LEDTA，并加入1.5mg/mL的溶菌酶，室溫下攪拌30分鐘；然后加入10μg/mL的DNaseI和20mmol/L的MgCl2，繼續(xù)作用30分鐘；加入終濃度為1.5mol/LNaCl、2％TritonX-100和3V的20mmol/LEDTA，4℃攪拌30分鐘，4℃條件下離心，12000rpm，20min，收集沉淀用3V的4mol/LUrea、2％TritonX-100、20mol/LEDTA、0.1mol/LTrispH8.0室溫洗滌30分鐘，沉淀再用8V的20mol/LEDTA、0.1mol/LTrispH7.0，室溫洗滌30分鐘，離心收集包涵體；包涵體用7M鹽酸胍、10mg/LDTT進行溶解，離心后上清用Sephacryl300進行凝膠過濾層析，洗脫液為7M鹽酸胍，收集洗脫液，分別對4M尿素、2M尿素和水進行透析復(fù)性，并對純化產(chǎn)物進行質(zhì)量鑒定。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了破傷風毒素T細胞表位肽與人B淋巴細胞刺激及因子融合蛋白及制備方法，TT表位肽-QYIKANSKFIGITE-(谷氨酰胺-酪氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-谷氨酸)可以刺激機體的CD4+T細胞反應(yīng)，促進機體的體液免疫水平。采用分步克隆，構(gòu)建TT與BLyS的融合基因，并在大腸桿菌中獲得高效表達。通過TT與BLyS融合，克服了機體的免疫耐受，使得機體發(fā)生高水平的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的BLyS多克隆中和抗體可以中和體內(nèi)的高水平的天然BLyS的B淋巴細胞刺激活性，從而發(fā)揮抗自身免疫性疾病的作用。 |
| 國際公布 |
